一种控制条件下合欢盆距兰种子快繁方法-尊龙凯时官方app下载

文档序号:36175367发布日期:2023-11-25 00:18阅读:40来源:国知局
一种控制条件下合欢盆距兰种子快繁方法

1.本发明涉及植物的组织培养技术,尤其涉及合欢盆距兰的组织培养方法,包括了外植体选择

消毒等处理

原球茎诱导形成

原球茎芽形成

发芽球茎生根诱导培养

幼苗移栽炼苗等步骤



背景技术:

2.兰科植物为被子植物的第二大科,全球有
899
属,
27801
种,均被列入

濒危野生动植物种国际贸易公约

的保护范围

我国兰科植物资源丰富,有
194
属,
1620
种,其中有
1257
种兰科植物被列入

国家重点保护野生植物名录

,丰富的兰科植物资源在森林生态系统维护及推动经济社会发展方面发挥了重要作用

合欢盆距兰为兰科盆距兰属植物,生于群山林中树干上

在我国分布地域狭窄,报道仅见于台湾中部山区,以及湖南新宁县

会同县境内

截止到
2022
年,新宁县总共发现合欢盆距兰
500


因数量稀少,野生动植物保护行政主管部门
2009
年将其列入

全国极小种群野生植物拯救保护实施方案


103
号物种

3.合欢盆距兰数量濒危

在湖南省林业局指导下,新宁县林业局已经在合欢盆距兰分布点建立了保护站,并安装了围栏

但因其生态系统脆弱,种子野外自然萌发极其困难,仅依靠就地保护和自然繁衍,难以确保其种群持续稳定

只有实现合欢盆距兰的人工繁育,并结合野外归化技术,促进种群恢复到足够基数,才能保障该物种在原生境可持续地繁衍生息

但目前尚未有合欢盆距兰繁育在技术上和野外实际归化中成功的案例见诸报道,也未有合欢盆距兰组培技术专利的申请

4.兰科植物种类繁多,目前部分种类已开展种子繁育特性研究,但不同种类之间差异较大,我们的前期研究表明,铁皮石斛种子经过
45d
左右诱导后,可产生原球茎

而春兰

建兰等国兰种子萌发则比较困难,即使经特殊处理,萌发也需要
150d。
可见,不同兰科植物种子萌发特性差异较大

迄今,关于合欢盆距兰种子萌发特性和促萌方法的研究尚未见报道

本发明公开一种以合欢盆距兰种子为繁殖材料,通过控制温度

湿度

光照强度

洁净度等环境因子和生物因子等条件,提高合欢盆距兰种子萌发率的方法



技术实现要素:

5.本发明的目的是针对现有促进兰科植物种子萌发技术的不足,提供一种简便

高效合欢盆距兰种子在控制条件下的萌发成苗方法

该方法首次利用合欢盆距兰未开裂成熟蒴果进行免
hgcl2消毒的消毒方法,获得大量种子作为外植体,并能快速诱导原球茎和不定芽,其原球茎和不定芽诱导率,以及生根率均达到优异水平

6.本发明的目的是通过以下方式实现的

7.一种合欢盆距兰在控制条件下的快繁方法,包括以下步骤:
8.(1)
未开裂的成熟蒴果经过消毒后无菌条件下获得种子;
9.(2)
种子诱导形成原球茎;
10.(3)
原球茎芽诱导;
11.(4)
发芽球茎生根诱导;
12.(5)
幼苗移栽炼苗

13.步骤
(1)
所述的未开裂的成熟蒴果是指合欢盆距兰于4月中旬开花授粉后,经历5~6个月果实成熟期,果实表面颜色为浅黄绿色至黄色,表面无病斑,无虫蛀且未开裂的健康成熟蒴果

14.步骤
(1)
蒴果的消毒过程如下:用水将蒴果表面冲洗干净后,按照无菌操作规范,先用
70

75
%的酒精浸泡
15

40s
,优选
20

30s
;然后用无菌水冲洗一次,再用1~3%的
naclo
浸泡2~
4min
,优选
1.5
~2%的
naclo
浸泡
2.5

3min
;随后用无菌水冲洗三次备用

15.进一步地,优选小心去掉蒴果顶端枯萎组织,不破坏蒴果的完整性,然后用自来水将蒴果表面冲洗干净后,置于超净工作台之无菌器皿上

16.进一步地,将步骤
(1)
消毒后的蒴果,无菌条件下,用灭菌滤纸吸干蒴果表面水分,然后剖开,将果皮内的种子备用

17.步骤
(2)
将步骤
(1)
得到的无菌种子撒播于原球茎诱导形成培养基中,培养基组分为
1/2ms
培养基
2

6mg/l 6-ba(
优选3~
4mg/l) 0.2

0.5mg/l(
优选
0.3

0.4mg/l)naa 0.3

0.8mg/ltdz(
优选
0.4

0.6mg/l)
,蔗糖浓度
30g/l
,琼脂粉浓度
6g/l
,调整
ph

5.8
,培养温度为
23
±
1℃
,湿度为
55

70

(
优选
60

65

)
;在光照
12h、
黑暗
12h
的光周期,光照强度
1500

2400lx
条件下培养,
20

30d
后,原球茎即大量形成

18.步骤
(3)
将步骤
(2)
得到的原球茎转移至原球茎芽诱导培养基中,并加入适量无菌水,使原球茎均匀平铺于培养基表面,培养基组分为
1/2ms
培养基
2

6mg/l 6-ba(
优选3~
4mg/l) 0.2

0.5mg/lnaa(
优选
0.3

0.4mg/l) 0.3

0.8mg/ltdz(
优选
0.4

0.6mg/l) 2

4g/l
活性炭
(
优选
2.5

3.5mg/l)
,蔗糖浓度
30g/l
,琼脂粉浓度
6g/l
,调整
ph

5.8
,培养温度为
23
±
1℃
,湿度为
55

70

(
优选
60

65

)
;在光照
12h、
黑暗
12h
的光周期,光照强度
1500

2400lx
条件下培养
25

40d
,原球茎即诱导长出芽,称为发芽球茎

19.步骤
(4)
将步骤
(3)
获得的发芽球茎转移至生根培养基中进行诱导生根培养,生根培养基组分为
1/2ms
培养基
0.2

0.8mg/lnaa(
优选
0.2

0.5mg/l) 1

5g/l
活性炭
(
优选2~
3g/l)

30g/l
的蔗糖以及
4g/l
的琼脂粉,调整
ph

5.8
,培养温度为
23
±
1℃
,湿度为
55

70

(
优选
60

65

)
;在光照
12h、
黑暗
12h
的光周期,光照强度
1500

2400lx
条件下培养
25

30d
后,发芽球茎开始陆续长根

20.步骤
(5)
待步骤
(4)
发芽球茎的根长出2条以上,平均长度1~
3cm
时,称为幼苗,此时可对瓶内幼苗进行炼苗

21.进一步地,移栽基质由泥炭土
(
粒径不超过
10mm)
:发酵腐熟松树皮
(
粒径9~
12mm)
:鹿沼土
(
粒径3~
6mm)
:蛭石
(
粒径3~
6mm)
按照体积比=
(7

12)

(6

10)

(3

6)

(3

6)
混合而成

22.优选移栽基质由泥炭土
(
粒径不超过
10mm)
:发酵腐熟松树皮
(
粒径9~
12mm)
:鹿沼土
(
粒径3~
6mm)
:蛭石
(
粒径3~
6mm)
按照体积比=
(8

10)

(7

8)

(4

5)

(4

5))
的体积比,混合后在
120℃
高温下灭菌1~
2h。
23.更进一步地,将装有幼苗的容器至于自然光和不超过
30℃
环境,培养
3d
,然后将容器瓶盖打开一半继续培养
12

24h
;从所述容器中取出幼苗,在
20

30℃
清水中轻轻洗掉根部附着的培养基,将苗移栽到配置好的高温灭菌的移栽基质中;苗移栽基质后,将炼苗容器
基质表面覆盖干苔藓,适量浇水后,置于相对湿度
70
%~
90

、、
遮阴度
50
%的自然光温室大棚中,每天通风3~5次;待单株叶片长至3~5片,叶长度长至1~
2cm
,将合欢盆距兰苗移栽至野外适生生境

24.本发明有益效果:本发明以合欢盆距兰种子为外植体,获得了合欢盆距兰从取得种子到在控制条件下培养成幼苗的全套技术方法

该技术方法具有以下优点:
25.(1)
省时

省力:外植体取自合欢盆距兰未开裂的成熟蒴果内的种子,不需要用到嫩芽

同时包含外植体的蒴果表面较嫩芽等组织更易去污

净化手续简单便捷

26.(2)
简便

高效


hgcl2残留:只需对包含大量种子外植体的蒴果用
70

75
%的酒精和1~3%的
naclo
进行分步消毒,最后用灭菌水稍加漂洗即可完成

不用
hgcl2消毒,因此无
hgcl2残留,也无需用大量的灭菌水来漂洗,节约了水资源,减少了对环境的潜在危害

上述灭菌剂无需直接作用于外植体

该方法消毒效果好,可将外植体污染率控制在6%以内

27.(3)
保护合欢盆距兰野生资源:外植体取自秋季未开裂的成熟蒴果

因合欢盆距兰种子在野外极难自行萌发,蒴果采收不会对野生合欢盆距兰的生长繁育造成影响

28.(4)
原球茎诱导效率高:使用本发明的技术方法,原球茎诱导率可达
90
%以上,高于已公布的同属的尖叶盆距兰用芽尖为外植体的诱导效率
1.。
技术优势明显

29.(5)
技术体系完整:提供了合欢盆距兰控制条件下培养过程中从外植体采集到球茎发芽生根培养的成套技术方法,并对各个技术环节进行了充分优化,最快
70d
左右即可获得完整的幼苗,适于合欢盆距兰种苗的规模化生产

附图说明
30.图1:合欢盆距兰未开裂的成熟蒴果;
31.图2:合欢盆距兰消毒后的蒴果种子平铺于原球茎诱导培养基中;
32.图3:合欢盆距兰原球茎诱导生成;
33.图4:合欢盆距兰原球茎平铺于原球茎芽诱导培养基中;
34.图5:合欢盆距兰球茎芽诱导生成;
35.图6:合欢盆距兰发芽球茎生根;
36.图7:合欢盆距兰幼苗移栽炼苗

具体实施方式
37.下列实施例中所用合欢盆距兰未开裂成熟蒴果材料来自湖南省新宁县合欢盆距兰分布保护点
。2022
年9月份由发明人之一采集获得;细胞分裂素
6-ba、tdz、
生长素
naa
购自于国药集团化学试剂有限公司

38.实施例139.本实施例中的
1/2ms
培养基为
ms
培养基中大量元素减半,其余组分和
ms
培养基相同

培养基a用于原球茎诱导形成,为
1/2ms
培养基中添加
3.5mg/l

6-ba、0.3mg/l

naa
以及
0.5mg/l

tdz
,蔗糖浓度
30g/l
,琼脂粉浓度
6g/l
,调整
ph

5.8
后获得;培养基b用于原球茎芽诱导培养,为
1/2ms
培养基中添加
3.5mg/l

6-ba、0.3mg/l

naa
以及
0.5mg/l

tdz
,蔗糖浓度
30g/l
,琼脂粉浓度
6g/l
,活性炭
3g/l
,调整
ph

5.8
后获得;培养基c用于发芽球茎诱导生根培养,为
1/2ms
培养基中添加
0.3mg/l

naa

2.0g/l
的活性炭,
30g/l
的蔗糖以及
4g/l
的琼脂粉,调整
ph

5.8
后获得

40.1.
外植体的选择
41.采集合欢盆距兰未开裂的成熟蒴果

蒴果采集标准为:合欢盆距兰于4月中旬开花授粉后,经历5个半月发育,至当年9月底,果实表面为浅黄绿色至黄色,表面无病斑,无虫蛀且未开裂的健康成熟蒴果
(

1)

42.2.
外植体的消毒
43.用自来水将蒴果表面冲洗干净后,置于超净工作台之无菌器皿上,按照无菌操作规范,先用
75
%的酒精浸泡
30s
;然后用无菌水冲洗一次,再用2%的
naclo
浸泡
3min
;随后用无菌水冲洗三次备用;数据统计结果显示,外植体污染率为3%;
44.3.
外植体的处理
45.将步骤2消毒后的蒴果,无菌条件下,用灭菌滤纸吸干蒴果表面水分,然后剖开,获得种子作为外植体备用;
46.4.
原球茎的诱导
47.在超净工作台内,无菌条件下,将步骤3处理后的外植体,用无菌镊子夹取无菌种子撒播于原球茎诱导形成培养基a中
(

2)
,培养温度为
(23
±
1)℃
,湿度为
80
%;在光照
12h(
光照强度
2000lx)、
黑暗
12h
的光周期条件下培养,
22d
后有原球茎诱导产生,
30d
后,原球茎诱导生成率为
92

(

3)

48.5.
原球茎芽诱导
49.将按步骤4所示方法操作之所得原球茎,将其用无菌镊子转移至原球茎芽诱导培养基b中,并加入适量无菌水,使原球茎均匀平铺于培养基表面
(

4)
,按照步骤4设定的光照培养周期

光强度

温度

湿度等培养条件培养,继续培养
26d
,原球茎即可诱导长出芽
(
如图
5)
,成为发芽球茎,
40d
后芽诱导生成率为
92
%;
50.6.
发芽球茎生根培养
51.将按步骤5所示方法操作后所得到的发芽球茎,在超净工作台中,直接将发芽球茎用无菌镊子夹起转移至生根培养基c中进行生根培养,按照步骤4设定的光照培养周期

光强度

温度

湿度等培养条件培养,培养
26d
后,发芽球茎开始陆续长根,培养至
40d
后,发芽球茎生根率为
95

(
如图
6)。
此即成幼苗

52.7.
幼苗移栽炼苗
53.待幼苗根长出2条以上,平均长度1~
3cm
时,即可进行炼苗

将装有幼苗的容器,从培养温室中移出,置于自然光和室温下
(25℃)
,培养
3d
,然后将容器瓶盖打开一半培养
12h
;从所述容器中取出幼苗,在室温
(25℃)
清水中轻轻洗掉根部附着的培养基,将幼苗移栽到配置好的移栽基质中

该基质由泥炭土
(
粒径不超过
10mm)
:发酵腐熟松树皮
(
粒径9~
12mm)
:鹿沼土
(
粒径3~
6mm)
:蛭石
(
粒径3~
6mm)
体积比9:8:4:4的体积比,混合后在约
120℃
高温下灭菌
2h。
幼苗移栽至盛基质的炼苗容器后,表面覆盖适量干苔藓,适量浇水后,置于相对湿度
80
%左右

遮阴
50
%的自然光温室大棚中,每天通风3次培养

培养
10d
后,组培苗成活率
95

(

7)。
待单株叶片长至5~7片,叶长度长至1~
2cm
,将合欢盆距兰幼苗移栽至野外适生生境即可

54.实施例255.本实施例中的
1/2ms
培养基为
ms
培养基中大量元素减半,其余组分和
ms
培养基相


培养基a用于原球茎诱导形成,为
1/2ms
培养基中添加
4mg/l

6-ba、0.4mg/l

naa
以及
0.4mg/l

tdz
,蔗糖浓度
30g/l
,琼脂粉浓度
6g/l
,调整
ph

5.8
后获得;培养基b用于原球茎芽诱导培养,为
1/2ms
培养基中添加
4mg/l

6-ba、0.4mg/l

naa
以及
0.4mg/l

tdz
,蔗糖浓度
30g/l
,琼脂粉浓度
6g/l
,活性炭
2g/l
,调整
ph

5.8
后获得;培养基c用于发芽球茎生根培养,为
1/2ms
培养基中添加
0.5mg/l

naa

3.0g/l
的活性炭,
30g/l
的蔗糖以及
4g/l
的琼脂粉,调整
ph

5.8
后获得

56.1.
外植体的选择
57.采集合欢盆距兰未开裂的成熟蒴果

蒴果采集标准为:合欢盆距兰于4月中旬开花授粉后,经历5个月发育,至当年9月份,果实已成熟,果实表面为浅黄绿色至黄色,表面无病斑,无虫蛀且未开裂的健康成熟蒴果;
58.2.
外植体的消毒
59.用自来水将蒴果表面冲洗干净后,置于超净工作台之无菌器皿上,按照无菌操作规范,先用
75
%的酒精浸泡
20s
;然后用无菌水冲洗一次,再用
1.5
%的
naclo
浸泡
2.5min
;随后用无菌水冲洗三次备用;数据统计结果显示,外植体污染率为4%;
60.3.
外植体的处理
61.将步骤2消毒后的蒴果,无菌条件下,用灭菌滤纸吸干蒴果表面水分,然后剖开,获得种子作为外植体备用;
62.4.
原球茎的诱导
63.在超净工作台内,无菌条件下,将步骤3处理后的外植体,用无菌镊子夹取无菌种子撒播于原球茎诱导形成培养基a中,培养温度为
(23
±
1)℃
,湿度为
60
%;在光照
12h(
光照强度
2000lx)、
黑暗
12h
的光周期条件下培养,
25d
后有原球茎诱导产生,
30d
后,原球茎诱导生成率为
90
%;
64.5.
原球茎芽诱导
65.将按步骤4所示方法操作所得之所得之原球茎,将其用无菌镊子转移至原球茎不定芽诱导培养基b中,并加入适量无菌水,使原球茎均匀平铺于培养基表面,按照步骤4设定的光照培养周期

光强度

温度

湿度等培养条件培养,继续培养
27d
,原球茎即可诱导长出芽,成为发芽球茎,
40d
后芽诱导生成率为
90
%;
6.
发芽球茎生根培养
66.将按步骤5所示方法操作后所得到的发芽球茎,在超净工作台中,直接将发芽球茎用无菌镊子夹起转移至生根培养基c中进行生根培养,按照步骤4设定的光照培养周期

光强度

温度

湿度等培养条件培养,培养
28d
后,发芽球茎开始陆续长根,培养至
40d
后,即成幼苗,发芽球茎生根率为
94


67.7.
移栽炼苗
68.待上述幼苗根长出2条以上,平均长度1~
3cm
时,即可进行炼苗

将装有幼苗的容器,从培养温室中移出,至于自然光和室温下
(25℃)
,培养
3d
,然后将装有幼苗的容器瓶盖打开一半培养
12h
;从所述容器中取出幼苗,在室温
(25℃)
清水中轻轻洗掉根部附着的培养基,将幼苗移栽到配置好的移栽基质中

该基质由泥炭土
(
粒径不超过
10mm)
:发酵腐熟松树皮
(
粒径9~
12mm)
:鹿沼土
(
粒径3~
6mm)
:蛭石
(
粒径3~
6mm)
体积比
10
:7:5:5的体积比,混合后在约
120℃
高温下灭菌
2h。
幼苗移栽基质后,表面覆盖适量干苔藓,将炼苗容器表面覆盖,浇水适量后,于相对湿度
80
%左右

遮阴
50
%的自然光温室大棚中,每天通风3次,培养
10d
后,幼苗成活率
92


待单株叶片长至5~7片,叶长度长至1~
2cm
,将合欢盆距兰种苗移栽至野外适生生境即可

69.对比例170.按照现有专利:名称为“一种尖叶盆距兰的组培快繁方法”,授权公告号中“cn106888970 b”中的方法对尖叶盆距兰进行培养,统计成苗时间,从新生营养芽到诱导成苗时间实施例中最快为
150d
,显著多于本技术实施例1中最快成苗时间
74d。
71.对比例272.按照现有专利:名称为“一种尖叶盆距兰的组培快繁方法”,授权公告号中“cn106888970 b”中的方法对尖叶盆距兰进行培养,从新生营养芽到诱导原球茎产生,时间最快为
90d
,诱导率最高为
82.9
%,而本技术从合欢盆距兰种子到诱导产生原球茎,时间最短仅需
25d
,且原球茎诱导生成率可达
90
%以上,原球茎诱导产生,从诱导时间到诱导效率均显著提高,为后续顺利成苗提供了丰富的原球茎材料

73.对比例3:
74.原球茎诱导形成培养基采用
1/2ms
培养基
0.5mg/l 6-ba 0.1mg/lnaa 1.0mg/l tdz
,蔗糖浓度
30g/l
,琼脂粉浓度
6g/l
,调整
ph

5.8
,培养温度为
23
±
1℃
,湿度为
60
%;在光照
12h、
黑暗
12h
的光周期,光照强度
2000lx
条件下培养,
40d
后有原球茎诱导产生,
50d
后,原球茎诱导生成率为
56


75.对比例4:
76.原球茎转移至原球茎芽诱导培养基中,并加入适量无菌水,使原球茎均匀平铺于培养基表面,培养基组分为
1/2ms
培养基
0.5mg/l 6-ba 0.1mg/lnaa 1.0mg/l tdz 1g/l
活性炭,蔗糖浓度
30g/l
,琼脂粉浓度
6g/l
,调整
ph

5.8
,培养温度为
23
±
1℃
,湿度为
60
%;在光照
12h、
黑暗
12h
的光周期,光照强度
2000lx
条件下培养,继续培养
45d
,原球茎即可诱导长出芽,
60d
后芽诱导生成率为
60


77.对比例5:
78.发芽球茎转移至生根培养基中进行生根培养,生根培养基组分为
1/2ms
培养基
1.0mg/l naa 0.5g/l
活性炭,
30g/l
的蔗糖以及
4g/l
的琼脂粉,调整
ph

5.8
,培养温度为
23
±
1℃
,湿度为
60
%;在光照
12h、
黑暗
12h
的光周期,光照强度
2000lx
条件下培后,培养
40d
后,发芽球茎开始陆续长根,培养至
50d
后,生根率为
45


79.以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围

80.参考文献:
81.1.玉林师范学院
.
一种尖叶盆距兰的组培快繁方法
:
中国
,cn106888970 b[p].2018.08.17。
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