用于食品发酵的新型枯草芽孢杆菌菌株的制作方法-尊龙凯时官方app下载

文档序号:454478阅读:1031来源:国知局
专利名称:用于食品发酵的新型枯草芽孢杆菌菌株的制作方法
技术领域
本发明涉及能够发酵豆子的新型芽孢杆菌菌株,其基本上不产生任何的异-戊酸。本发明特别涉及新型纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)的菌株,其中产生异-戊酸的生物合成途径所涉及的一个或多个基因基本上是非-功能性的。
人类长期以来使用各种微生物,如酵母、真菌或细菌来生产食料,以便改良、制备或改变食品的性能/味道。这种微生物中的一种是属于用于不同植物组织(如豆,例如大豆和(非洲)角豆荚,和种子,例如非洲油料豆的种子、棉花籽、瓜子等)发酵的枯草芽孢杆菌的土壤细菌。在发酵过程中,枯草芽孢杆菌降解含在起始原料中的纤维素或/和蛋白质,从而产生可被进一步加工或即可食用的发酵产品。
与枯草芽孢杆菌紧密相关的一种细菌被称作纳豆芽孢杆菌菌株,一种主要用于大豆发酵的食品级的、革兰氏阳性的微生物,其发酵过程最终产生廉价和富含氨基酸的营养食品。术语纳豆芽孢杆菌来源于商业生产和早餐上常吃的日本大豆发酵产品“纳豆”(见k.h.steinkraus等,handbook of indigenous fermented food,第9卷.(1983),530-547)。
采用用于食品生产的微生物进行生物起始原料的发酵过程中存在的缺点是产生了多种不受消费者欢迎的副产物,如味道差的或硬度不合适的产物。
为此,jp-08275772描述了特定枯草芽孢杆菌菌株用于降低终产物“纳豆”中氨含量的用途。通过在发酵早期将蛋白酶活性保持在高水平,以使全部的大豆蛋白基本上被充分降解来达到此目的,而在发酵后期蛋白酶活性显著下降以致于不会产生大量的最终破坏食品味道的氨。
在jp-09009903中描述了另外一种改进了半纤维素的降解特性以致于增加了终产物柔软度的枯草芽孢杆菌菌株。
然而,尽管微生物如枯草芽孢杆菌的发酵食品的性能在多方面得到了改进,但仍需要进一步改进终产品的味道/气味。
因此本发明的目的在于进一步改进通过采用枯草芽孢杆菌进行发酵所得到的食品的性能,尤其是改进其味道。
通过提供一种新型的能够发酵豆子,优选地是发酵大豆的枯草芽孢杆菌的微生物菌株来解决上述目的,所述菌株不会产生大量的异-戊酸。
附图中

图1表示ywfl破裂产物的构建流程图。
图2表示含有图1中的ywfl破裂产物的重组载体pmz66。
图3表示由野生型纳豆芽孢杆菌和ywfl破裂等基因衍生物产生的发酵产物的色谱图。
在本发明的进一步实验中,发现通过采用枯草芽孢杆菌,尤其是采用纳豆芽孢杆菌进行发酵所得到的产物香味受到繁殖期间由微生物产生的被称作异-戊酸(2-甲基丁酸和3-甲基丁酸)的特殊化合物的不利影响,该化合物使得发酵产物粘稠、质硬和具有刺激性的气味。
已知在微生物中支链脂肪酸如异-戊酸的主要用途在于合成其中支链脂肪酸的组成大约为90%的细胞膜。细胞膜的合成是任何细胞的基本功能。由于用于形成细胞膜的任何脂肪酸的产量降低或甚至于全部耗尽而可能最终导致微生物在正常条件下不能成活或不能完成它们作为发酵剂的功能,因此,一种组分的生物合成所受到的影响预计是一项繁琐的事情。
尽管不清楚枯草芽孢杆菌产生异-戊酸的确切生物合成途径,但根据新近获得的枯草芽孢杆菌的全部基因组信息设计了可能的合成途径(kunst,f.等的“完整的革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌的基因组序列”,自然390(1997),249-256)。
为此,还假设了在由细菌生产异-戊酸和类似支链脂肪酸的过程中,源自于基因ywfl的多肽可能起着重要的作用。
为了达到这一目的,异-戊酸合成的生物合成途径所涉及的主题-枯草芽孢杆菌菌株的一个或多个基因基本上是以非功能状态提供的,因此其各自的基因产物显示了较低的活性或着本身可能就根本没有被翻译成基因产物。
在一个优选的实施方案中,这可以通过例如修饰异-戊酸合成的生物合成途径所涉及的主要枯草芽孢杆菌菌株的一个或多个基因来达到,优选地ywfl基因(自然,出处同上)是这样的方式即其基因产物仅显示了降低的活性,优选地强烈降低的活性或是非-功能性的。这些基因产物可含有在合成途径中起着酶作用或起着异-戊酸生产调节剂作用的多肽。在一个优选的实施方案中,ywfl基因可能会从基因组中缺失或被修饰以致于基因不能被转录成功能蛋白质。
在另一个优选的实施方案中,属于枯草芽孢杆菌的修饰菌株是纳豆芽孢杆菌,最优选地是纳豆芽孢杆菌bn10,其已遵照布达佩斯条约被保藏在巴斯德学院(institute pasteur)中,保藏号是i-2077。
使用新型枯草芽孢杆菌菌株的目的是用于食料,进一步优选在枯草芽孢杆菌中不含外源序列,如载体序列或编码选择标记如抗生素抗性的基因。这同样适用于存在这样的序列如染色体外dna或整合到染色体中的dna的情况。
新型菌株可以通过已知技术如采用已知诱变剂诱变普通枯草芽孢杆菌菌株并选择所需要的特征,即在发酵过程中异-戊酸合成低或缺陷。使用的诱变剂和技术是本技术领域已知的并且非限制性的实例是例如dmso(二甲亚砜)、mnng(n-甲基-n’-硝基-n-亚硝基胍)、甲胺或放射性处理等。
而且,目的枯草芽孢杆菌菌株还可通过重组基因技术获得,优选地没有任何外源dna插入其中,这将在下文中详细描述。
本发明的新型枯草芽孢杆菌菌株可被用于植物原料的发酵来最终由此生产出食料、食用香料,或更优选地为纳豆。
下文中,新型和稳定的、食品级、遗传修饰的生物体-纳豆芽孢杆菌的构建被描述为包括一个染色体ywfl基因的等基因缺失。这一缺失被发现是稳定的和不含有不需要的dna序列,如用于构建的载体序列或抗生素抗性标记。而且,通过缺失ywfl基因所获得的微生物显示了与已知纳豆芽孢杆菌菌株相同的功能,表明新型菌株的发酵特性并没有因ywfl基因产物的缺失而受损。
除非另外说明,全部技术、条件和培养基都如sambrook等在《分子克隆实验室手册,第二版》(1992),冷泉港实验出版社,纽约中所描述的。
质粒、细菌菌株和培养基在大肠杆菌菌株bz234中进行(重组)大肠杆菌载体pbssk( )(stratagene,产品号212205)的dna扩增(mollet,b.等“嗜热链球菌中直接的基因组整合、基因置换和整合基因的表达”,细菌学杂志175(14)(1993),4315-4324)而通过抗生素氨苄青霉素boehringer mannheim、产品号835242)的手段来选择重组菌株。重组质粒采用x-gal(5-溴-4氯-3-吲哆-β-d-吡喃半乳糖苷,boehringer mannheim,产品号1680293)和iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷,boehringer mannheim,产品号1411446)来鉴定。
质粒pg host9(maguin,e.等“在乳球菌和其它革兰氏-阳性细菌中的有效插入诱变”细菌学杂志178(3)(1996),931-935)是一种含有抗生素红霉素(fluka,产品号e6376)抗性基因和温度敏感性质粒复制蛋白质的革兰氏-阳性/革兰氏阴性穿梭载体。pg host9在大肠杆菌ec101中进行繁殖(law,j.等“在乳酸乳球菌中发生突变的系统允许进行定向基因的快速分析”,细菌学杂志177(24)(1995),7011-7018),提供了为了适于保留和扩增质粒而整合在基因组中的非温度敏感性复制蛋白。
这项工作中使用的纳豆芽孢杆菌菌株(称作bn1)是从市场上购买的发酵纳豆中分离出来的。
生长培养基是lb培养基,培养大肠杆菌的温度是37℃,培养纳豆芽孢杆菌的温度是28℃或37℃,同时进行搅拌。培养大肠杆菌时加入红霉素的量是150μg/ml,培养纳豆芽孢杆菌时加入红霉素的量是2-4μg/ml。
纳豆芽孢杆菌染色体dna的提取进行用于pcr的纳豆芽孢杆菌染色体dna的提取,并且对在根据需要加入或没有加入抗生素的lb培养基中培养16小时的培养物进行dna印迹分析。在6000rpm的条件下离心培养物8分钟来沉淀细菌。将沉淀物悬浮在500μl的50mm葡萄糖、25mm tris-hcl ph8.0、10mm edta加上500μg/ml的溶菌酶(boehringer mannheim,1243004)中并在37℃下温育30分钟。变溶菌素(fluka,m9901)被加到1μg/ml并继续在37℃下温育30分钟。蛋白酶k(fluka,p6556)被加到20μg/ml,edta加到2.5mm并且最后通过加入0.1%sds(serva,20763)将细胞进行裂解。将该溶液在60℃条件下温育1小时并且用等体积的苯酚-氯仿再一次对裂解物进行提取。混合物在14000rpm下离心8分钟来分相。小心除去水相并通过加入2体积的95%的乙醇(fluka,02860)来沉淀染色体dna。用灭菌牙签缠绕dna沉淀,将收集到的dna沉淀转移到400μl的10mm tris-hcl ph8.0、10mm edta和50μg/ml rna酶(boehringer,109169)中并在60℃条件下温育1小时。用苯酚-氯仿提取溶液。将dna进行沉淀,缠绕并最终悬浮在200μl的te缓冲液中(10mm tris-hcl ph8.0,1mmedta)。
ywfl缺失质粒pmz66的构建ywfl基因侧翼的dna片段由纳豆芽孢杆菌菌株bnl进行扩增并最终通过其掺入同源物的引物结合在一起(fusion cycle pcr)以便创建一种适于这种细菌中的ywfl基因破裂的dna片段。这在图1中进行了图示说明。
采用从microsynth、balgach、瑞士获得的寡核苷酸6624(seq.id.no.1)和6626(seq.id.no.2)扩增5’侧翼区,其中所述的6624在ywfl基因起始端的上游大约950bp处引入了一个bamhⅰ限制性酶切位点,而所述的6626为一种含有离ywfl基因的起始端50bp区域的22bp的序列和离ywfl基因的末端100bp区域的22bp的组合寡核苷酸。该寡核苷酸序列限定了缺失的区域,即组合引物两个区段间删除的序列。寡核苷酸6626的第二个区段还被设计成引进了两个tga终止密码子以便终止截断的ywfl基因的翻译。
采用寡核苷酸6625(seq.id.no.3)和6627(seq.id.n0.4)扩增3’侧翼区,其中所述的6625在ywfl基因末端的下游大约1000bp处引进了一个ecorⅰ限制性酶切位点,而所述的6627为第二种基本上是寡核苷酸6626(seq.id.no.2)之反向-互补序列的组合寡核苷酸。这些互补的寡核苷酸序列提供了5’和3’片段间的同源性,所述5’和3’片段被用于无引物、pwo指导的延伸反应中来完成第二条链。最终加入了所述两种寡核苷酸6626和6625并且特别扩增了正确的缺失片段。
pcr反应按如下方式进行。将500ng的染色体dna和100μl体积的含有80μl无菌水、6μl 2mm dntps、10μl pwo聚合酶反应缓冲溶液、2μl的大约100nm的每种寡核苷酸和0.5μl的pwo聚合酶(boehringer mannheim,产品号1644 947)进行混合。采用一种perkin elmer dna热循环仪扩增所要的片段,扩增条件是95℃、1分钟,40℃、1分钟,72℃、2分钟和最终维持在4℃,循环20次。在100μl体积的含有80μl无菌水、6μl 2mm dntps、10μl pwo聚合酶反应缓冲溶液和0.5μl的pwo聚合酶(不含任何寡核苷酸)中制备来源于每一pcr反应的1μl样品。在上述热循环仪中,将这种对照反应循环两次来延伸同源诱导的寡核苷酸。最后,加入2μl的大约100nm的每一寡核苷酸6624和6625并继续进行20次循环的pcr反应。
采用一种qiaquikpcr纯化试剂盒(qiagen,产品号28104)来纯化最终pcr产物。用限制酶ecorⅰ和bamhⅰ消化样品并在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳。从凝胶上切下相应的2kb片段并利用qiaquik凝胶提取试剂盒(qiagen,产品号28704)洗脱dna。获得的dna片段用限制酶ecorⅰ和bamhⅰ消化后与相应预处理过的大肠杆菌载体pbs sk (用ecorⅰ/bamhⅰ消化并去磷酸化)进行连接。连接混合物被电转化入大肠杆菌菌株bz234中并且在补充了100μg/ml氨苄青霉素、xgal和iptg的lb平板上选择转化子。通过限制性分析由此分离的质粒(sambrook,出处同上)筛选出潜在阳性的、白色菌落。测定阳性克隆插入片段的dna序列以便证实pcr的构建。用限制酶ecorⅰ和speⅰ消化这一质粒并且在1%的琼脂糖凝胶上分离片段。从凝胶上切下相应的2kb片段并利用qiaquick凝胶提取试剂盒洗脱dna。
用限制酶ecorⅰ和speⅰ消化复制-温度敏感载体pg host9并且通过采用虾碱性磷酸酶(usb,产品号70092)来去除末端磷酸。ywfl缺失片段与如此预处理的pg host9载体混合并由此进行连接。连接混合物被电转化到大肠杆菌宿主ec101中。通过分离质粒的限制性分析来筛选菌落。一个阳性质粒被命名为pmz66(图2)。
为了转化到bn1中,用jetstar maxi制备试剂盒(genomed,220010)分离大量的pmz66。
纳豆芽孢杆菌的转化根据以下方案进行转化实验溶液培养基ⅰ:spizizen的盐5x,2ml;葡萄糖50%,0.1ml;酪蛋白氨基酸20%,0.01ml;酵母抽提物5%,0.02ml;硫酸镁1m 0.05ml;用蒸馏水调到10ml。
培养基ⅱ:spizizen的盐5x,2ml;葡萄糖50%,0.1ml;酪蛋白氨基酸20%,0.005ml;硫酸镁1m 0.05ml;用蒸馏水调到10ml。
spizizen的盐5x:(nh4)2so410g,k2hpo470g,kh2po430g,柠檬酸三钠·2h2o 5g,硫酸镁·7h2o 1g,添加蒸馏水到1升。
纳豆芽孢杆菌的天然感受态将37℃培养过夜的lb平板上的2-3个菌落重新悬浮到2.5ml的培养基ⅰ中并在10ml无菌玻璃试管中在37℃下通气(240rpm)培养4至5小时。
纳豆芽孢杆菌的转化在加入了质粒dna(在最多50μl中5至10μg)的培养基ⅱ(0.45ml中0.05ml)中进行10倍稀释。在30℃下通气(240rpm)培养过夜。然后将等分试样或全部体积平铺在选择培养基上(具有4μg/ml红霉素的用于pg host9的lb)并在28℃下培养两天。
以分离的两个步骤进行纳豆芽孢杆菌ywfl基因的缺失。在第一个步骤(环入)中,选择了通过同源重组(由侧翼dna同源性定向)的pmz66的整合。在第二个步骤(环出)中,利用了便于基因组切除的质粒复制并鉴定了所需要的细菌克隆。
pmz66的环入用质粒pmz66转化的纳豆芽孢杆菌菌株bn1被接种到补充了2μg/ml红霉素的新鲜lb培养基中并在42℃下培养16小时。将培养物进行稀释并平铺到补充了2μg/ml红霉素的lb平板上并在42℃下进行培养。在这一温度下,pg host9质粒复制蛋白不再具有活性。因此,那些选择的细菌极少在ywfl基因上发生质粒整合。这一整合由与ywfl缺失片段同源的dna序列来定位并在5’或3’同源区域内进行。采用特别设计的pcr引物、在小规模的整合体培养物上测定5’或3’整合的发生(42℃)。这说明大多数染色体整合的事件发生在ywfl基因的5’区,只有约1096的整合发生在3’端。通过dna印迹分析确定这些克隆。
pmz66的环出在ywfl基因的5’端整合了pmz66的阳性克隆以1%的接种量接种到含有2μg/ml红霉素的lb培养基中并在42℃下培养16小时。然后将这一培养物以1%的量接种到lb培养基的新鲜培养物上并在28℃下培养16小时。稀释培养物,平铺到lb平板上,然后在42℃下培养。
过程的论据如下在28℃下,pg host9质粒复制蛋白又有活性了并且复制的恢复增强了从基因组中切除质粒的能力,而最终的铺平板和在42℃下的培养再次切除了引起任意复制质粒丢失的pg host9质粒复制蛋白(非红霉素选择)。
当在环入反应中,质粒pmz66被认为对通过两个不同途径的环出具有两个选择ⅰ)在相同5’侧翼dna中通过重组,如通过整合,而返回到最初的亲本bn1,或ⅱ)在3’侧翼dna中通过重组,就是通过将缺失片段掺入到基因组中并除去pg host9载体的染色体ywfl基因。
在42℃下培养产生的菌落主要显示了大菌落中有一些较小菌落存在。划在lb平板和补充了2μg/ml红霉素的lb平板上的复制物确定了所有的小菌落和一些检测的大菌落是红霉素敏感型。
采用被设计成通过缺失点扩增的引物的pcr扩增被用来测定所有的大菌落携带野生型-bn1 ywfl基因,而小菌落全部含有所设计ywfl基因的缺失。
通过测定在ywfl基因缺失点的dna的序列来确定pcr结果,其显示了构建体的预测序列。通过dna印迹杂交确定ywfl基因周围区域的排列并通过与其质粒杂交测得没有pg host9载体序列存在。从独立实验鉴定出五种这样的ywfl缺失菌株并命名为bn10(i-2077)到bn14。
ywfl缺失菌株的hplc分析将获得的纳豆芽孢杆菌菌株bn1和5ywfl缺失菌株(bn10到bn14)在lb培养基中、37℃下培养16小时。通过0.2微米的过滤器(schleicher & schuell.fp030/3)过滤来除去该细菌并通过hplc分析脂肪酸的组成。hplc是通过hplc hewlett packard系列1100仪器进行的,该仪器采用了在40℃下进行稳定的和用10mm h2so4以1ml/分钟的流速进行洗脱的aminex快速酸100×7.5mm柱(bio-rad,产品号125-0100)。采用也是在40℃下进行稳定的hp1047a折射计(hewlett packard)获得了检测结果。
所述结果见表1,从中可明显看出异戊酸是通过纳豆芽孢杆菌的发酵产生的,而ywfl基因的缺失将该发酵产物的产生降低到最低值。
表1通过bn1和5ywfl缺失衍生物bn10-bn14产生异戊酸的水平测定
下列实施例是来说明本发明的而不是用来限制所附权利要求的保护范围。
实施例1立方体的制备根据本技术领域已知的技术,将大豆粉碎、煮熟并接种纳豆芽孢杆菌菌株bn10(i-2077)的孢子,接着在30-50℃下进行固态发酵(曲型发酵)2-5天。向得到的发酵混合物中加入盐水(nacl饱和溶液)。将产物进行干燥,压成立方体或以粉末的形式使用,例如用作汤产品。最终的产品不具有含异戊酸的普通产品的味道。
因此与通常使用的枯草芽孢杆菌相比,新型枯草芽孢杆菌在大豆发酵过程中同样进行得很好。
实施例2重复与实施例1相同的过程,其条件是接种的是野生型纳豆芽孢杆菌(bn1)。得到的产品具有含异戊酸的产品的典型味道。
序列表(1)总体信息(ⅰ)申请人societe des produits nestlé,s.a.
p.o.box353ch-1800 vevey发明人b.molletr.d.pridmorem.-c-zwahlen(ⅱ)发明名称用于食品发酵的新型枯草芽孢杆菌菌株(ⅲ)序列的数目4(ⅳ)地址(a)地址kirschner & kurig(b)街道sollnerstr.38(c)城市慕尼黑(d)州bavaria(e)国家德国(f)区号81479(ⅴ)计算机可读形式(a)介质类型软盘(b)计算机ibmpc兼容机(c)系统pc-dos/ms-dos(d)软件patentin公布nr.1,版本nr.1,25(ⅵ)申请的信息(a)申请号已获得(b)申请日同此(c)分类(ⅶ)优先权日无(ⅷ)代理人/代理机构信息(a)姓名straus,alexander(b)注册号85880(c)案卷号80,032(ⅸ)电讯(a)电话(089)749858-0(b)电传(089)749858-11(2)序列1的信息(ⅰ)序列特征(a)长度30核苷酸(b)类型核酸(c)链型单链(d)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型dna(ⅹⅰ)序列描述序列1gcggcggatccgctgatgatctcccacccc 30(3)序列2的信息(ⅰ)序列特征(a)长度44核苷酸(b)类型核酸(c)链型单链(d)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型dna(ⅹⅰ)序列描述序列2ctcaaattccatttcctcatcaggacatgcatagcgtatcatcc44(3)序列3的信息(ⅰ)序列特征(a)长度31核苷酸(b)类型核酸(c)链型单链(d)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型dna(ⅹⅰ)序列描述序列3ggggtcgaattccacgagatatcraactgcc 31(4)序列4的信息(ⅰ)序列特征(a)长度44核苷酸(b)类型核酸(c)链型单链
(d)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型dna(ⅹⅰ)序列描述序列4ggatgatacgctatgcatgtcctgatgaggaaatggaatttgag4权利要求
1.一种能够发酵豆子的枯草芽孢杆菌的细菌菌株,其不产生大量的异戊酸。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株,其为纳豆芽孢杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌菌株,其中一种或多种源自于异-戊酸生物合成过程中所涉及的基因的基因产物具有降低的活性,基本上是非-功能性的或缺失的。
4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌菌株,其中活性降低的、基本上是非-功能性的或缺失的基因产物源自于ywfl基因。
5.根据前面任意一项权利要求所述的枯草芽孢杆菌菌株,其不含外源dna序列。
6.根据前面任意一项权利要求所述的枯草芽孢杆菌菌株,其通过重组基因技术来制备。
7.根据权利要求1至5中的任意一项权利要求所述的枯草芽孢杆菌,其通过诱变和选择来制备。
8.根据权利要求6所述的枯草芽孢杆菌菌株,其为纳豆芽孢杆菌i-2077。
9.前面任意一项权利要求所述的枯草芽孢杆菌用于发酵植物原料的用途。
10.根据权利要求9所述的用途,其用于食品的制备。
11.根据权利要求9所述的用途,其用于香料化合物的制备。
12.根据权利要求10所述的用途,其用于纳豆的制备。
全文摘要
本发明涉及能够发酵豆子的新型枯草芽孢杆菌菌株,其基本上不产生任何的异-戊酸。本发明特别涉及新型纳豆芽孢杆菌菌株,其中产生异-戊酸的生物合成途径中所涉及的一个或多个基因基本上是非-功能性的。
文档编号a23l1/20gk1321192sq99811687
公开日2001年11月7日 申请日期1999年9月15日 优先权日1998年10月2日
发明者b·莫莱特, r·d·普里德莫雷, m·c·兹瓦伦 申请人:雀巢制品公司
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