细胞分离装置和分离方法-尊龙凯时官方app下载

文档序号:3551502阅读:631来源:国知局
专利名称:细胞分离装置和分离方法
技术领域
本发明涉及采用新的重组抗体分离细胞的装置和使用该装置分离或检测细胞的方法。作为更具体的例子,本发明涉及使用抗人cd(族分化)4抗原或cd34抗原的新重组抗体分离或检测人cd4或cd34阳性细胞的方法和分离这些细胞的装置。
而且,本发明涉及对人cd4抗原具有特别高亲和力和高特异性的抗体、含有这些抗体的医药组合物,它们可用于抗原的定量测定或检测以及在药物制剂和医学设备中的应用。
本领域背景通过使用抗人血细胞表面抗原的抗体,可从血细胞群体中仅分离、除去、回收或检测特定细胞。例如,除去cd4阳性细胞可改善自身免疫病患者的症状,而回收cd34阳性细胞可浓缩可用于移植的造血前体细胞。
人cd4是分子量为55kd的糖蛋白,在细胞膜上以单体形式存在,并主要在t细胞中表达。表达cd4的t细胞(约65%的外周t细胞)具有辅助t细胞的特性,并识别ii类mhc分子呈递的抗原。而且,cd4已知结合hiv(人免疫缺陷病毒aids病毒)并充当感染时的受体。在免疫系统中,辅助t细胞对于对抗原的适当应答是必不可少的,并为大多数b细胞抗体应答所必需。当其识别与主要抗原呈递细胞表面结合的异物抗原时辅助t细胞被激活,并分泌白介素2以刺激t细胞的增殖,这反过来又协助了b细胞的激活并进一步促进抗体产生。有一些辅助t细胞不仅辅助淋巴细胞,而且通过分泌γ干扰素激活巨噬细胞。
在健康个体中,为防止自身紊乱,具有各种机制如具有自身反应性抗原受体的淋巴细胞克隆缺失、其克隆的无反应性和这些功能的抑制(免疫耐受)。尽管自身免疫病发生的机制尚未完全了解,但认为这些免疫耐受机制的紊乱引起了自身免疫病。具有自身反应性抗原受体的淋巴细胞克隆不限于那些表达cd4的辅助t细胞。然而,已经公认辅助t细胞在自身免疫病中是重要的。
作为某些自身免疫病的治疗方法,可根据症状的程度施用肾上腺皮质激素制品、脾脏提取物、免疫抑制剂等。但是,无论是药物治疗还是脾脏切除,均有许多病例显示没有有效痊愈。实际上,已经证明对于这些患者没有完美的治疗方法,以致需要加紧采取对策。
作为自身免疫病的另一种治疗方法,已经以各种方式尝试了通过使用免疫吸附柱进行血液体外循环吸附自身抗体来清除。例如,已对含有固定了a蛋白的载体的柱子的应用进行了研究,所述a蛋白能结合免疫球蛋白。但是,a蛋白很昂贵,并且在吸附特异性上不是非常好。而且,发生副作用的病例也有报道。因此,在可在医学硬件中使用之前仍有各种问题有待解决。
最近不仅报道了从血液除去液体因子的方法,还有血细胞分离技术。然而存在各种问题,包括取决于所用配体的抗原结合能力很弱,由于与抗原的低反应特异性或其它原因细胞不能有效清除,或非特异地吸附了非靶细胞。
jp-a-3-32680公开了固定了具有t淋巴细胞亲和力的肽或脂质的分离材料。jp-a-6-154316、jp-a-6-154317、jp-a-6-218051和jp-a-6-269663公开了由无纺织物组成了的cd4阳性细胞收集材料,所述无纺织物已固定了具有cd4阳性细胞亲和力的肽。它们都具有用作配体的肽对抗原的亲和力和特异性不足以致没有令人满意的细胞吸附力的问题。特别地,后者使用与抗cd4抗体形成抗原结合位点密切相关的互补决定区“cdr”和它们之间的构架区“构架”的部分肽。仅使用其一部分并不提供有效的抗原结合。已知对于每个h链和l链,cdr包括从n端一侧的三个区,称为“cdr-1”、“cdr-2”和“cdr-3”。对于有效抗原结合重要的是,h链和l链至少一个的“cdr-1”、“cdr-2”和“cdr-3”的立体构型保持与抗体的立体构型基本相同。
传统上,人cd34被报道成未分化造血细胞的细胞表面抗原,并且产生抗my10抗体的杂交瘤被认为是产生识别人cd34分子的抗体的细胞(美国专利4,965,204和免疫学杂志(j.immunology),133,157(1984))。此后,出现了许多关于抗人cd34抗体的报道,并试图将它们用于分离未分化造血细胞和医学领域中的类似目的如骨髓移植。为了有效利用这些指向医学治疗的应用,越来越需要有效产生抗人cd34抗体和开发利用它们的医学设备。
已知cd34分子是未分化血细胞上表达的未分化细胞抗原标志,而且也报道了它们在分离未分化细胞中的应用(s.saeland等,血液(blood)72,1580(1988),等)。而且,联合使用抗cd34抗体和生物素、抗生物素蛋白或磁珠,人们正在开发将未分化细胞与分化细胞和癌细胞的群体分开的医学设备(dreger等,exp.hematol.23,147(1995))。
通常,抗体对抗原具有很强的结合能力并且特异性高,以致可期望用于医学治疗。然而,医学设备的制造关心生产抗体的成本。必需有效产生抗体和将它们用于医学设备。为此,作为有效产生抗体的方法,期望建立制备重组抗体和将它们用于医学设备的技术。
本发明公开本发明通过基因工程技术进行修饰形成例如人-鼠嵌合体和形成单链抗体同时保持抗体具有的对人cd4抗原的高亲和力和高特异性,并提供能降低抗原性、增加抗体产生量和降低生产成本的重组抗体。
生物体存在的普通抗体需要抗原特异的可变区核苷酸序列和恒定区基因。已知恒定区有少数类型。相反,h链和l链的可变区核苷酸序列变异非常高,因此获得目标可变区核苷酸序列需要很大努力。然而,本发明人运用基因扩增(pcr)、使用抗原的酶免疫测定(eia)或流式细胞仪等实验,从杂交瘤的多个抗体基因获得了编码靶标人cd4抗体和人cd34抗原的基因,并按如下测定了它们的序列和功能。而且,本发明人重组了这些基因以大量产生人-鼠嵌合抗体和单链抗体。
使用重组抗体可产生迄今为止从鼠腹水获得或通过细胞培养或细菌等获得的抗体。这样,医学设备将可以较低的成本供应。
通常,单克隆抗体的制备始于从用靶抗原免疫的动物分离b淋巴细胞和将它们与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤。然后,用靶抗原进行筛选获得产生抗体的杂交瘤。在此,为了获得产生对抗原具有高结合能力和高特异性的抗体的杂交瘤,必须筛选许多细胞,需要很大努力。
作为本发明人深入研究的结果,现已发现,如下抗体对人cd4抗原具有高亲和力和高特异性,这种抗体的从产生抗cd4抗体的杂交瘤4h5提取的h链可变区的cdr-1、cdr-2和cdr-3分别是序列表中序列号1、2和3所述氨基酸序列,并且其从产生抗cd4抗体的杂交瘤4h5提取的l链可变区的cdr-1、cdr-2和cdr-3分别是序列表中序列号4、5和6所述氨基酸序列。
例如,据报道抗人cd4抗体okt4a对人cd4抗原的结合亲和力为ka=4×108m-1(virginia l.pulito等,免疫学杂志(the journal ofimmunology),1562840-2850(1996))。因此,解离常数(kd该值越低,结合亲和力越高)是kd=2.5×10-9m(因为1/ka=kd)。另一方面,如下文的实施例所述,4h5抗体对人cd4抗原的解离常数是kd=8.08×10-10m(实施例5)。这显示4h5抗体比okt4a抗体对人cd4抗原结合更强。
产生4h5抗体的杂交瘤即鼠-鼠杂交瘤4h5保藏在日本国际贸易与工业部工业科学技术局生物科学和人类技术国家研究所(national instituteof bioscience and human-technology,agency of industrial science andtechnology,ministry of international trade and industry,japan),保藏号为ferm bp-6729。
生物体中存在的普通抗体需要抗原特异的可变区核苷酸序列和恒定区基因。已知恒定区基因有少数类型。相反,h链和l链的可变区核苷酸序列变异非常高,因此获得靶标可变区核苷酸序列需要很大努力。但是,本分明人运用基因扩增(pcr)或使用抗原的酶免疫测定(eia)等实验,从杂交瘤的多个抗体基因获得了抗人cd4抗原的靶标抗体基因,并重组了这些基因以大量产生人鼠嵌合抗体和单链抗体。
普通抗体每一个包括较大和较小的两类多肽。较大多肽亚基称为“h链”,较小多肽亚基称为“l链”。这些肽各自由存在于n端一侧并形成抗原结合位点的“可变区”(或“v区”)和抗体类型间恒定的“恒定区”(或“fc”)组成。可变区进一步分为与抗原结合位点形成密切相关的互补决定区“cdr”和它们之间的构架区“构架”。已知每一个h链和l链的cdr包括从n端一侧的三个区,称为“cdr-1”、“cdr-2”和“cdr-3”。

图1是描述igg结构的示意图。
构成抗体可变区的氨基酸数目常随抗体的不同而不同。4h5抗体h链的可变区的氨基酸序列见序列表的序列号35。在序列表的序列号35中,第1-30位氨基酸是构架1,第31-35位氨基酸是cdr-1,第36-49位氨基酸是构架2,第50-66位氨基酸是cdr-2,第67-98位氨基酸是构架3,第99-107位氨基酸是cdr-3,第108-117位氨基酸是构架4。4h5抗体l链的可变区的氨基酸序列见序列表的序列号36。在序列表的序列号36中,第1-23位氨基酸是构架1,第24-36位氨基酸是cdr-1,第39-53位氨基酸是构架2,第54-60位氨基酸是cdr-2,第61-92位氨基酸是构架3,第93-101位氨基酸是cdr-3,第102-111位氨基酸是构架4。构架和cdr之间的分界是参考“免疫学上有用蛋白质的序列”(sequencesof proteins of immunological interest)(第5版,1991,美国nih出版)所述鼠抗体可变区的基因序列来确定的。
序列表中序列号7显示了序列表中序列号35第9-118位氨基酸相应的核苷酸序列。序列表中序列号8显示了序列表中序列号36第9-111位氨基酸相应的核苷酸序列。
序列表中序列号39显示了抗my10抗体h链可变部分的基因序列及其编码的氨基酸序列,所述抗体是与抗cd34抗原结合的抗体。在序列表的序列号39中,第1-30位氨基酸是构架1,第31-35位氨基酸是cdr-1,第36-49位氨基酸是构架2,第50-65位氨基酸是cdr-2,第66-97位氨基酸是构架3,第98-106位氨基酸是cdr-3,第107-117位氨基酸是构架4。
序列表中序列号40显示了抗my10抗体l链可变部分的基因序列及其编码的氨基酸序列。在序列表的序列号40中,第1-23位氨基酸是构架1,第24-39位氨基酸是cdr-1,第40-54位氨基酸是构架2,第55-61位氨基酸是cdr-2,第62-93位氨基酸是构架3,第94-102位氨基酸是cdr-3,第103-113位氨基酸是构架4。
序列表中序列号41显示了单链抗体的基因序列及其编码的氨基酸序列。在序列表的序列号41中,第1-39位氨基酸是含有大肠杆菌分泌信号的序列,第40-156位氨基酸是h链的可变区,第157-171位氨基酸是一个接头,第172-284位氨基酸是l链的可变区,第285-302位氨基酸是含有e标签的序列。
质粒pcantab5e(pharmacia)具有含h链和l链一部分即第140-169位氨基酸的序列作为接头。本发明中使用了该质粒。
本发明质粒包含的可与h链和l链结合的接头不限于上述序列,而且均可使用。从杂交瘤分离单链抗体的方法可使用重组噬菌体抗体系统试剂盒(recombinant phage antibody system kit),harmacia)等。然而在不存在筛选所需的人cd34抗原时(如本发明中),试剂盒不可能有效使用,所以需要很大的创造性。
本发明涉及下列分离细胞的装置和使用该装置分离或检测细胞的方法。(1)使用含有可与cd4分子结合的嵌合抗体或单链抗体或其组合的抗体分离cd4阳性细胞的装置。(2)使用包含如下h链可变区、l链可变区和人fc区的嵌合抗体分离cd4阳性细胞的装置,其中h链可变区的cdr-1的氨基酸序列是asp tyrval ile asn(序列表中的序列号1),cdr-2的氨基酸序列是glu ile tyrpro gly ser gly ser ala tyr tyr asn glu met phe lys gly(序列表中的序列号2),cdr-3的氨基酸序列是arg gly thr gly thr gly phe ala tyr(序列表中的序列号3),而l链可变区的cdr-1的氨基酸序列是lys alaser gln ser val asp tyr asp gly asp ser tyr met asn(序列表中的序列号4),cdr-2的氨基酸序列是ala ala ser asn leu glu ser(序列表中的序列号5),cdr-3的氨基酸序列是gln gln ser ser glu asp pro prothr(序列表中的序列号6)。(3)使用包含如下h链可变区和l链可变区的单链抗体分离cd4阳性细胞的装置,其中h链可变区的cdr-1的氨基酸序列是asp tyr val ileasn(序列表中的序列号1),cdr-2的氨基酸序列是glu ile tyr pro glyser gly ser ala tyr tyr asn glu met phe lys gly(序列表中的序列号2),cdr-3的氨基酸序列是arg gly thr gly thr gly phe ala tyr(序列表中的序列号3),而l链可变区的cdr-1的氨基酸序列是lys ala sergln ser val asp tyr asp gly asp ser tyr met asn(序列表中的序列号4),cdr-2的氨基酸序列是ala ala ser asn leu glu ser(序列表中的序列号5),cdr-3的氨基酸序列是gln gln ser ser glu asp pro pro thr(序列表中的序列号6)。(4)使用含有可与cd4分子结合的嵌合抗体或单链抗体或其组合的抗体分离或检测cd4阳性细胞的方法。(5)使用包含如下h链可变区、l链可变区和人fc区的嵌合抗体分离或检测人cd4阳性细胞的方法,其中h链可变区的cdr-1的氨基酸序列是asp tyr val ile asn(序列表中的序列号1),cdr-2的氨基酸序列是glu ile tyr pro gly ser gly ser ala tyr tyr asn glu met phe lys gly(序列表中的序列号2),cdr-3的氨基酸序列是arg gly thr gly thr glyphe ala tyr(序列表中的序列号3),而l链可变区的cdr-1的氨基酸序列是lys ala ser gln ser val asp tyr asp gly asp ser tyr met asn(序列表中的序列号4),cdr-2的氨基酸序列是ala ala ser asn leu gluser(序列表中的序列号5),cdr-3的氨基酸序列是gln gln ser ser gluasp pro pro thr(序列表中的序列号6)。(6)使用包含如下h链可变区和l链可变区的单链抗体分离或检测人cd4阳性细胞的方法,其中h链可变区的cdr-1的氨基酸序列是asp tyrval ile asn(序列表中的序列号1),cdr-2的氨基酸序列是glu ile tyrpro gly ser gly ser ala tyr tyr asn glu met phe lys gly(序列表中的序列号2),cdr-3的氨基酸序列是arg gly thr gly thr gly phe ala tyr(序列表中的序列号3),而l链可变区的cdr-1的氨基酸序列是lys alaser gln ser val asp tyr asp gly asp ser tyr met asn(序列表中的序列号4),cdr-2的氨基酸序列是ala ala ser asn leu glu ser(序列表中的序列号5),cdr-3的氨基酸序列是gln gln ser ser glu asp pro prothr(序列表中的序列号6)。
此外,本发明还涉及下列分离细胞的装置和使用该装置分离或检测细胞的方法。(1)使用含有可与cd34分子结合的嵌合抗体或单链抗体或其组合的抗体分离cd34阳性细胞的装置。(2)使用包含如下h链可变区、l链可变区和人fc区的嵌合抗体分离cd34阳性细胞的装置,其中h链可变区的cdr-1的氨基酸序列是ser-his-gly-val-his(序列表中的序列号43),cdr-2的氨基酸序列是val-ile-trp-gly-ala-gly-arg-thr-asp-tyr-asn-ala-ala-phe-ile-ser(序列表中的序列号44),cdr-3的氨基酸序列是asn-arg-tyr-glu-ser-tyr-phe-asp-tyr(序列表中的序列号45),而l链可变区的cdr-1的氨基酸序列是arg-ser-ser-gln-asn-leu-val-his-ser-asn-gly-asn-thr-tyr-leu-his(序列表中的序列号46),cdr-2的氨基酸序列是lys-val-ser-asn-arg-phe-ser-gly-val-pro-asp-arg-phe(序列表中的序列号47),cdr-3的氨基酸序列是ser-gln-ser-thr-his-val-pro-leu-thr(序列表中的序列号48)。(3)使用包含如下h链可变区和l链可变区的单链抗体分离cd34阳性细胞的装置,其中h链可变区的cdr-1的氨基酸序列是ser-his-gly-val-his(序列表中的序列号43),cdr-2的氨基酸序列是val-ile-trp-gly-ala-gly-arg-thr-asp-tyr-asn-ala-ala-phe-ile-ser(序列表中的序列号44),cdr-3的氨基酸序列是asn-arg-tyr-glu-ser-tyr-phe-asp-tyr(序列表中的序列号45),而l链可变区的cdr-1的氨基酸序列是arg-ser-ser-gln-asn-leu-val-his-ser-asn-gly-asn-thr-tyr-leu-his(序列表中的序列号46),cdr-2的氨基酸序列是lys-val-ser-asn-arg-phe-ser-gly-val-pro-asp-arg-phe(序列表中的序列号47),cdr-3的氨基酸序列是ser-gln-ser-thr-his-val-pro-leu-thr(序列表中的序列号48)。(4)上述(1)-(3)之任一项所述的分离cd34阳性细胞的装置,所使用的抗体在该抗体氨基酸序列的c端或n端或两端加入了含有碱性氨基酸或酸性氨基酸的氨基酸序列。(5)使用含有可与cd34分子结合的嵌合抗体或单链抗体或其组合的抗体分离或检测cd34阳性细胞的方法。(6)使用包含如下h链可变区、l链可变区和人fc区的嵌合抗体分离或检测人cd34阳性细胞的方法,其中h链可变区的cdr-1的氨基酸序列是ser-his-gly-val-his(序列表中的序列号43),cdr-2的氨基酸序列是val-ile-trp-gly-ala-gly-arg-thr-asp-tyr-asn-ala-ala-phe-ile-ser(序列表中的序列号44),cdr-3的氨基酸序列是asn-arg-tyr-glu-ser-tyr-phe-asp-tyr(序列表中的序列号45),而l链可变区的cdr-1的氨基酸序列是arg-ser-ser-gln-asn-leu-val-his-ser-asn-gly-asn-thr-tyr-leu-his(序列表中的序列号46),cdr-2的氨基酸序列是lys-val-ser-asn-arg-phe-ser-gly-val-pro-asp-arg-phe(序列表中的序列号47),cdr-3的氨基酸序列是ser-gln-ser-thr-his-val-pro-leu-thr(序列表中的序列号48)。(7)使用包含如下h链可变区和l链可变区的单链抗体分离或检测人cd34阳性细胞的方法,其中h链可变区的cdr-1的氨基酸序列是ser-his-gly-val-his(序列表中的序列号43),cdr-2的氨基酸序列是val-ile-trp-gly-ala-gly-arg-thr-asp-tyr-asn-ala-ala-phe-ile-ser(序列表中的序列号44),cdr-3的氨基酸序列是asn-arg-tyr-glu-ser-tyr-phe-asp-tyr(序列表中的序列号45),而l链可变区的cdr-1的氨基酸序列是arg-ser-ser-gln-asn-leu-val-his-ser-asn-gly-asn-thr-tyr-leu-his(序列表中的序列号46),cdr-2的氨基酸序列是lys-val-ser-asn-arg-phe-ser-gly-val-pro-asp-arg-phe(序列表中的序列号47),cdr-3的氨基酸序列是ser-gln-ser-thr-his-val-pro-leu-thr(序列表中的序列号48)。(8)上述(5)-(7)之任一项所述的分离或检测人cd34阳性细胞的方法,所使用的抗体在该抗体氨基酸序列的c端或n端或两端加入了含有碱性氨基酸或酸性氨基酸的氨基酸序列。
而且,本发明还涉及下列抗体、编码该抗体的核酸、使用该核酸生产抗体的方法和含有该抗体的医药组合物。(1)含有如下h链可变区并对cd4抗原具有亲和力的抗体,该h链可变区的cdr-1、cdr-2和cdr-3的氨基酸序列分别是序列表中的序列号1、2和3。(2)含有如下l链可变区并对cd4抗原具有亲和力的抗体,该h链可变区的cdr-1、cdr-2和cdr-3的氨基酸序列分别是序列表中的序列号4、5和6。(3)保藏号为ferm bp-6729的杂交瘤4h5产生的抗cd4抗原的单克隆抗体。(4)编码上述(1)-(3)之任一项所述抗体的核酸。(5)上述(4)所述核酸,其含有序列号7和8所述核苷酸序列。(6)使用上述(4)或(5)所述核酸产生抗体的方法。(7)可通过上述(6)的方法获得的对cd4抗原具有亲和力的重组抗体。(8)上述(7)的重组抗体,其中该抗体的fc区是人的。(9)上述(7)的重组抗体,其中该抗体是单链抗体。(10)含有上述(1)-(3)之任一项所述抗体和药物学上可接受载体的医药组合物。(11)含有上述(7)-(9)之任一项所述重组抗体和药物学上可接受载体的医药组合物。
本文所用“抗体”除了生物体中通常存在的那些形式的抗体外,还包括含有由抗体h链或l链可变区或二者的组合形成的至少一个抗原结合位点的分子。例如,它包括仅由h链可变区组成的肽、由一套h链片段和l链片段组成的fab、由两套h链片段和l链片段组成的(fab')2、在相同肽上含有串联结合的h链片段和l链片段的单链抗体“scfv”等。
本文所用“人cd4抗原”已由parnes,j.r.(adv.immunology,44,265(1989))报道,并已知是在淋巴细胞上表达的辅助t细胞的抗原标志。在人类,cd4抗原在单核细胞、巨噬细胞等上表达。
通过鼠抗体的人源化可显示抗体结合抗原的抗原特异性和强度主要取决于cdr的氨基酸序列(gussow,d.和seemann,g.,酶学方法(methodsin enzymology),20399-121(1991);glaser,s.m.等,免疫学杂志1492607-2614(1992))。
对于cos7细胞表达和分泌抗体,可使用各种载体(whittle,n.和adair,j.等(1987),protein eng.,1(6),499-505;sutter,k.d.和feys,v.等(1992),基因(gene)113,223-30)。使用人抗体表达质粒(pg1),制备了可表达人-鼠嵌合抗人cd4抗体的质粒pg14h5和可表达人cd34抗体的质粒pg1my10。通过将这些基因转移至cos7细胞,可产生人抗cd4抗体。本文使用的人-鼠嵌合抗体是指由具有来自杂交瘤的鼠基因序列的可变区和具有人基因序列的恒定区构成的基因所产生的抗体。pg1是通过除去加在pse质粒(见国际公布wo 95/15393)中的人cγ1序列上的跨膜域(tm)获得的质粒,由此获得改善,使抗体可象普通抗体一样在生物体中分泌。其制备的细节见参考实施例1。也就是说,它具有编码人恒定区的基因序列,并能通过连接鼠可变区基因表达人-鼠嵌合抗体。
本文所用“嵌合抗体”是指通过人工组合不同动物物种抗体的氨基酸序列获得的抗体。例如,它可指含有来自鼠杂交瘤的cdr并在恒定区含有来自人抗体的氨基酸序列的抗体。而且,其构架可含有人的氨基酸序列。
本文所用“人cd34抗原”已由civin等(美国专利4,965,204和免疫杂志,133,157(1984))报道,并已知是未分化造血细胞的抗原标志,在未分化血细胞上表达。
本文所用“功能基本相同”是指抗原分子上的表位和对抗原的结合能力基本相同。已知即使在可变区的构架或恒定区中发生氨基酸替代,仍然常常产生功能基本相同的抗体。鼠抗体的人源化显示,抗体结合抗原的抗原特异性和强度主要取决于cdr的氨基酸序列(gussow,d.和seemann,g.,酶学方法(methods in enzymology),20399-121(1991);glaser,s.m.等,免疫学杂志1492607-2614(1992))。
cos7细胞通常使用加入了10%胎牛血清(fbs)的dulbecco'smodified eagle's medium(dmem培养基)在5%co2存在下于37℃培养。向cos7细胞转移基因的方法和基因转移之后细胞饲养生产的方法见实验教科书如t.yokota和k.arai,生物手册系列之四(bio manualseries 4),基因转移和表达分析方法(gene transfer and expressionanalysis method),yodosha出版(1994)。向cos7细胞转移基因的方法可以是deae葡聚糖法(bebbington,c.r.(1991);方法酶学方法指南(methodsa companion to methods in enzymology),2(2),136-45)以及电穿孔法。
在本发明中,pg1中包含的恒定区基因是cγ1,这样每一个克隆都表达成igg1。产生抗体时,为了避免来自血清的牛抗体的污染,期望在无血清dmem培养基上进行培养。分泌在培养基上清中的抗cd4抗体可容易地使用纯化普通igg抗体的方法纯化,例如使用a蛋白或g蛋白。
作为工业生产的宿主,cho细胞和骨髓瘤sp 2/0细胞是人们熟知的(xiang,j.等(1990)分子免疫学(mol.immnn.),27,809;bebbington,c.r.等(1992)bio/technology,10,169;larrick,j.w.和wallace,e.f.等(1992)免疫学评论(immunol.rev.)130,69-85;deyev,s.m.和lieber,a.等(1994)appl.biochem.biotechnol.47(2-3),143-54)。例如,对于cho细胞,已报道了用试剂如mix筛选具有高产量的克隆的方法(bebbington,c.r.(1991)方法酶学方法手册,2(2),136-45)。如果可获得稳定高产株系,则可将该株系用于重组抗人cd4抗体的工业生产。
当用作医药制品时,与鼠抗体相比,人-鼠嵌合抗体在人体内的抗原性极低,并且其安全性更加改善。当普通抗体通过用蛋白酶如胃蛋白酶分解转换成f(ab')2时,利用人fc的片段与来自鼠的片段相比安全性高。当将它用于医学设备时,用作配体的抗体有可能经过蛋白酶等分解以细微的量释放。考虑到这些分解物,可以说人源化的抗体安全性更高。
对于单链抗体,通过减少分子量可望实现降低抗原性。通过用蛋白酶如木瓜蛋白酶处理转化成fab的抗体仍然含有鼠恒定区。相反,单链抗体则没有,所以抗原性可降低至非常低的水平。作为从杂交瘤分离单链抗体的方法,可使用重组噬菌体抗体系统试剂盒(recombinant phageantibody sysiem kit,pharmacia)等。然而,当单链抗体对生产宿主大肠杆菌有毒,并引起大肠杆菌死亡或发生单链抗体分解时,试剂盒不可能有效使用,所以需要很大的创造性。单链抗体可通过研究诱导型载体如质粒pse380(invitrogen)或质粒pet24d( )(novagen)和用作宿主的细菌种来制备。在生产中,除了上述方法外,还可有效使用真核细胞表达系统、昆虫细胞表达系统和酵母细胞表达系统。对于连接h链和l链的接头,使用由三个(gly-gly-gly-gly-ser)重复组成的15个氨基酸残基。但是,可使用不限于该序列的接头。
使用本发明生产的抗体可分离cd4阳性细胞。根据本发明,有可能从体外血细胞悬液或体外循环的血液有效分离cd4阳性细胞。分离的细胞或除去了cd4阳性细胞的细胞群可用于各种疾病的治疗。除去了cd4阳性细胞的细胞混合液或血液制品的制备或主要成分为cd4阳性细胞的细胞悬液或cd4阳性细胞制品的制备可很容易进行。通过除去cd4阳性细胞,可望改善慢性风湿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮等自身免疫病的症状。
作为抗体的构型,可使用产生的抗体分子本身。也可使用含有通过用各种蛋白酶处理获得的抗原结合位点的片段fab、f(ab')2、fv、fd等。这些片段在例如“抗体工程导论(introduction to antibodyengineering)”(chijinshokan)等中有解释。此外,当本发明用于人体血液体外循环时,考虑到抗体在血液中释放的副作用和抗原性,使用可变区之外的部分由人抗体组成的嵌合抗体是有用的。制备抗体的方法没有特别限制,但必需使用纯化至高纯度的抗体。产生单克隆抗体的方法可以是在鼠腹腔中增殖杂交瘤、从腹水中回收产生的抗体的常用方法或从无血清培养基的培养物上清获得抗体的方法。对于打断的肽,它们可通过抗体分子的酶处理获得。然而,它们也可采用遗传工程技术从细菌、酵母等产生。联合这些方法获得的单克隆抗体、来自单克隆抗体的抗体片段、肽等可获得更强的结合能力。
作为分离细胞的方法,目前正在开发特别是使用抗体分离单一靶细胞的方法。例如,可提及分离荧光抗体标记细胞的方法、对靶细胞具有亲和力的配体固定化在水不溶性载体上而靶细胞直接或间接与它们结合的方法、免疫吸附柱分离法和使用免疫磁珠的分离方法。
分离荧光抗体标记细胞的方法是,首先将细胞混合液与识别靶细胞上表达的膜抗原的荧光标记单克隆抗体一起孵育,然后通过细胞分选仪等用激光束照射处理的细胞,利用只有抗体结合细胞产生的荧光分离荧光抗体结合细胞。
国际公布wo 87-04628描述了两个方法,一个方法是在分离设备表面直接固定化之后使用靶细胞膜表面所存在抗原的单克隆抗体,另一个方法是,首先将细胞混合液与结合靶细胞膜抗原的单克隆抗体一起孵育,然后在分离细胞的设备中处理,其中该设备已固定了与细胞表面上抗体结合的配体如抗免疫球蛋白抗体。细胞分离是抗原阳性细胞直接或间接与固定化于载体或设备的单克隆抗体结合的细胞分离方法。在这些方法中,分离在固定了抗体的塑料盘上发生,首先将细胞混合液倒入抗体固定化的塑料盘上,孵育塑料盘以使抗体与靶细胞的膜抗原结合。孵育后,洗涤塑料盘除去未结合的细胞并分离它们。免疫吸附柱法是,靶细胞膜抗原的配体如抗体固定化在小珠的表面,这些小珠填充在柱中,由此分离细胞。
国际公布wo 91-16116描述了如下方法,其中向细胞混合液加入生物素标记的靶细胞膜抗原的抗体,孵育混合物以形成细胞-抗体-生物素的连接,然后通过一个填充了多孔丙烯酰胺凝胶组成的固定了抗生物素蛋白的小珠的柱子,利用生物素-抗生物素蛋白的强结合,通过在柱子上结合分离靶细胞。
在免疫磁珠法中,首先将细胞混合液与结合了抗体的磁珠孵育,使靶细胞以磁珠标记。标记后,可使用磁性设备分离标记细胞和未标记细胞。
然而,要实现用这些方法分离细胞,需要大量抗体分子,在用于特别是医学用途时其成本会受到关注。本发明产生的重组抗体可很容易减低成本。
作为识别相同细胞的两种或多种抗体直接固定化的载体,可采用水不容性载体。也可联合cd4分子和其它在cd4阳性细胞上表达的分子,如充当hiv感染第二受体(一种g蛋白偶联受体)的fusin(cxcr-4)(feng,y等,科学(science),272(5263),872-877(1996)),或也充当hiv第二受体的ccr-5(deng,h等,自然(nature),381(6584),661-666(1996))等。由于这些分子表达频率较低,分离效率不是太高。然而,通过同时联合识别cd4分子的抗体和识别这些分子抗体,可分离这些表达细胞。
类似地,可使用直接固定了识别相同细胞上不同抗原分子的两种或多种抗体的载体。可联合cd34分子和其它未分化细胞上表达的分子如scf受体c-kit(yarden等,embo j.,6,3341(1987))、受体flk-2(mathews等,细胞(cell),65,1143(1991))、白介素3受体的α链(kitamura等,细胞,66,1165(1991))等。这些分子表达频率低,分离效率也较低。然而,同时联合cd34分子和抗体可使其表达细胞能够分离。
例如,首先将生物素或磁珠与待与细胞相连的抗体结合,然后,与容易结合生物素或磁珠的物质如结合或含有抗生物素蛋白或磁性的水不溶性载体反应,可很容易回收结合细胞的水不溶性载体。此外,通过首先将靶标未分化造血细胞与cd34抗体反应,然后将细胞和结合了抗免疫球蛋白抗体的水不溶载体反应,并洗涤或回收水不溶性载体,可选择性单独分离靶细胞。使用固定化于水不溶性载体磁珠上的抗体,可利用磁铁等更有效地进行分离。本发明所用容器可以采用例如填充了水不溶性载体的柱子、填充了水不溶性载体的烧瓶或烧瓶样容器等形式。分离未分化造血细胞的装置可由这种形状的容器和直接或间接固定化了抗体的水不溶性载体组合构成。通过将它们与流动细胞悬液、生理盐水等的泵联合,也可制造作为细胞分离系统的高适应性的装置。
本发明所用的容器可以采用例如填充了水不溶性载体的柱子、填充了水不溶性载体的烧瓶或烧瓶样容器等形式。分离cd4阳性细胞的装置可由这种形状的容器和直接或间接固定化了抗体的水不溶性载体组合构成。通过将它们与流动细胞悬液、生理盐水等的泵联合,也可制造作为分离细胞系统的高适应性的装置。
当将抗体固定化于水不溶性载体时,通过插入其间的间隔臂结合该抗体和水不溶性载体是有用的。而且,如果需要,水不溶性载体和化合物可通过具有可选择长度的分子(间隔臂)相互结合。关于该间隔臂的细节,可参考例如“亲和层析(affinity chromatography)”(k.kasai等,tokyo kagaku dojin出版社(199d,第105-108页)。间隔臂的例子包括聚亚甲基链和聚乙二醇链等。间隔臂的长度优选500埃或更短,更优选200埃或更短。作为通过间隔臂将化合物与水不溶性载体结合的方法,可提及的方法是,例如使用琼脂糖作为水不溶性载体,琼脂糖的羟基与用作间隔臂的1,6-己二异氰酸酯一侧的异氰酸酯基反应并结合,然后将剩下的异氰酸酯基与抗体的氨基、羟基、羧基等反应和结合,等等。
本文使用的水不溶性载体是指室温时在水溶液中是固态的载体,并可采用任何形式。形式的例子包括球体、立方体、盘、碎片、纤维、扁平薄膜、海绵、空心纤维等。其中,从易于最紧密填充、抗体易于在表面上相对均匀地保持、保证相对大的有效面积和细胞悬液的流动性看,球体、颗粒和纤维形式是可取的。
只要表面能结合抗体,水不溶性载体可是无机或有机化合物。然而,期望的是有机聚合化合物,因为它们在与细胞悬液接触时产生的洗脱液更少,而且它们的形状可更容易调整。这些例子包括乙烯基化合物的聚合物或共聚物或其衍生物,例如聚丙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酸和聚乙烯醇、基于聚酰胺的化合物如尼龙-6或-66、基于聚酯的化合物如聚对苯二甲酸乙二醇酯、植物的多糖化合物如纤维素等。它们可与磁铁结合使这种水不溶性载体回收更容易。
有利地,本发明进行水不溶性载体的修饰和在表面导入亲水性。来自生物体的蛋白质如白蛋白和球蛋白的固定化、合成功能基团的导入可给水不溶性载体表面赋予亲水性。赋予亲水性的合成功能基团的例子包括含有2-1,500个重复单位的聚乙二醇链、羟基、酰胺基、醚基和酯基。然而,聚乙二醇链和羟基可相互结合或分开存在。具有赋予亲水性的聚乙二醇链的单体的例子包括末端甲氧甲基丙烯酸酯如甲氧二甘醇甲基丙烯酸酯和甲氧三甘醇甲基丙烯酸酯、末端甲氧丙烯酸酯如甲氧二甘醇丙烯酸酯和甲氧三甘醇丙烯酸酯、和具有末端羟基的甲基丙烯酸酯和丙烯酸酯,其中结合氢原子而不是甲基,和通常具有包含2-1,500个重复单位且其末端含有至少一个可聚合功能基团的聚乙二醇链的单体。而且,当直接与载体结合时,合成功能基团包括具有2-1,500个重复单位的聚乙二醇衍生物。具有赋予亲水性的其它取代基团的单体例子包括乙烯基吡咯烷酮等,但不限于此。而且可存在一或多个可聚合功能基团。可聚合功能基团是指可通过单个、两个或多个功能基团聚合的功能基团。其例子包括碳碳重键化合物如乙烯基、乙炔基、二烯基、环状结构如环氧基和氧杂环丁烷基等,但不限于此。
而且,非离子功能基团可与上述功能基团一起存在。其例子包括特别是那些旨在改善亲水性的非离子功能基团,如酰胺基如二甲基酰胺、二乙基酰胺和二异丙基酰胺基、聚酯链如芳香聚酯链和脂肪族聚酯链如聚对苯二甲酸乙二醇酯链和聚对苯二甲酸丁二醇酯链、聚醚链如甲二醇链和丙二醇链、聚碳酸酯链等非离子亲水性功能基团,或通常旨在赋予疏水性的非离子功能基团如烷基链、氟化烷基链、烯丙基链等。任何上述功能基团均可共存。优选地,那些具有非离子亲水性功能基团的载体给出很好的结果。
作为修饰水不溶性载体和在其表面上赋予亲水性的方法,可使用任何已知的方法如在基质表面用共价键、离子键、放射线或等离子体接枝的方法、物理吸附、包埋或沉淀的不溶化。因此,有利地,本发明可使用通过已知方法进行表面修饰的方法,所述已知方法例如用放射线或等离子体或形成共价键进行聚合化合物或其单体的接枝聚合(jp-a-1-249063和jp-a-3-502094)。
抗体在水不溶性载体表面固定化的方法包括通过使用化学方法或放射线或电子束的接枝法将抗体与水不溶性载体表面共价结合的方法、采用化学方法通过水不溶性载体表面的功能基团将抗体与水不溶性载体表面共价结合的方法或类似的方法。其中,优选通过功能基团共价结合的方法,因为它没有在使用时引起抗体洗脱的危险。在水不溶性载体具有覆盖层时,可将抗体固定在该覆盖层表面上。
作为获得用于抗体在水不溶性载体或其覆盖层的表面上固定化的活化基团的例子,可提到卤化氰法、表氯醇法、双环氧法、溴乙酰溴法、卤代乙酰胺法等。更具体地,可提到氨基、羧基、羟基、巯基、酸酐、琥珀酰亚胺、取代卤素基团、醛基、环氧基、甲苯磺酰基等。考虑到抗体固定化的简便,特别期望溴化氰法、n-氢琥珀酰亚胺基法和卤代乙酰胺法。
作为用作活化基团的卤代乙酰氨基甲基化试剂,有利地,可使用n-羟甲基氯乙酰胺、n-羟甲基氟乙酰胺、n-羟甲基溴乙酰胺、n-羟甲基碘乙酰胺等。其中从经济和稳定的观点看,优选使用n-羟甲基溴乙酰胺、n-羟甲基碘乙酰胺等。在导入活化基团之后通过用碘化钾或溴化钾溶液处理,导入水不溶性载体的氟基或氯基可容易地转换成碘基或溴基。作为用于产生已导入活化基团的水不溶性载体的酸催化剂,只要是强酸,可使用任何酸,特别是质子酸。非限制性例子包括三氟甲烷、甲烷、苯、甲苯等的磺酸衍生物,并且使用friedel-crafts催化剂如硫酸、氯化锌、氯化铝和四氯化锡是有利的。
本发明基因产生的抗体与毒素结合,可给慢性风湿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮等患者施用,以减少具有自体反应性抗原受体的cd4阳性淋巴细胞克隆。这些修饰的抗体可用于通过血液成分部分清除法(apheresis)和外周血淋巴细胞悬吊法从患者回收的外周血。通过联合其它抗体的可变区的基因,也可能生产双特异性抗体和多特异性抗体。
而且,本发明提供含有本发明上述单克隆抗体和药物学上可接受载体的医药组合物。
由此获得的本发明抗cd4抗体基因能使抗cd4抗体有效产生,并提供各种形式的治疗制品。由此产生的重组抗体可与用于给人体施用时保持抗体活性的物质一起包含在医药组合物中,所述物质例如含有药物学上可接受组分的载体和稳定剂。作为载体和稳定剂,可列举人血清白蛋白、明胶等。术语“药物学上可接受”是指施用时不存在不良副作用如恶心、眩晕、呕吐、对频繁施用的制品产生免疫应答。另外,它们可与适当药物学上可接受的溶剂、稀释液和稳定剂一起采用液体医药组合物的形式。而且,除了上述医药组合物外,为了调节在生物体中的浓度,它们可采用缓释移植物的形式,如微球体、脂质体等。
在本发明中,当进行胃肠外给药(注射)时,适当的嵌合抗体和单链抗体的量是约10ug-1mg/kg体重。当细胞在体外处理时,其适当量是约0.1ug-1mg/ml。
通过联合其它抗体的可变区的基因,可生产双特异性抗体和多特异性抗体。术语多特异性抗体是指具有至少两种识别不同抗原或表位的抗原结合位点的抗体。其中,双特异性抗体是指具有两或多种识别不同抗原或表位的抗原结合位点的抗体。例如,其中一个普通抗体的抗原结合位点识别cd4抗原或cd34抗原、而其另一个抗原结合位点识别t淋巴细胞抗原cd3等的双特异性化抗体可强烈识别cd4阳性t淋巴细胞或cd34阳性白血病细胞中的淋巴细胞,所以可诱导清除白血病细胞的效应等。除了cd3外,可使用普通淋巴细胞标志如cd2、cd5、cd6和cd7。通过将它们联合起来并使它们表达成igm,可制备双特异性或多特异性抗体。除了在产生时的双特异性化外,还可通过产生和纯化单克隆抗体然后将这些抗体相互结合来获得双特异性或多特异性化。
对于单链抗体,生产时可进行双特异性或多特异性化,并可通过在一个肽上重复排列多个抗原识别位点的h链和l链可产生双特异性或多特异性抗体。在生产和纯化之后可实现结合。
有可能在相同分子上不仅对不同抗原组合,而且可对不同表位组合。例如,可组合不同抗cd4抗体。已报道了若干抗cd4抗体。例如,leu-3a抗体、leu-3b抗体(becton dickinson)、okt4抗体、okt4a抗体(ortho)、t4抗体(coulter)、mt310抗体(dacco)、f101-69抗体、16p25抗体(biosys)、edu-2抗体、mem-115抗体(synbas biotechnology)、7e14抗体(exulfia公司)、bl4抗体、13b8.2抗体(immunotech)、kt69-7抗体(labvision公司)、b-f51抗体(progen biotechnique)、bl-th4抗体(sun viobv)、94b1抗体、l197抗体、l80抗体、l93抗体、l201抗体、l34抗体、l202抗体、l200抗体、l252抗体、73f11抗体、72g4抗体、nuth1抗体、l71抗体、rft4抗体、mt151抗体、mt321抗体(d.g.healey等,欧洲免疫学杂志(eur.j.immnnol.)21,1491(1991))、okt4b抗体、okt4c抗体、okt4d抗体、okt4e抗体、okt4f抗体、q6d3抗体、l77抗体、l104抗体、l83抗体、l190抗体、l122抗体、l120抗体(matthias merkenschiager等,the j.immunol.,145,2839,1990)等是已知的,可分离这些抗体基因用于生产。
同样,有可能在相同分子上不仅对不同抗原组合,而且可对不同表位组合。例如,可组合不同抗cd34抗体。已报道了若干抗cd34抗体。例如,抗hpca-2抗体(becton dickinson)、抗hpca-1抗体(bectondickinson)、4a1(nichirei)、b1.3c5(katz等,leuk.res.,9,191(1985))、12.8、115.2(andrews等,血液,67,842(1966))、ich3(watt等、白血病(leukaemia),1,417(1987))、tuk3(unchanska-ziegler等,组织抗原(tissue antigens)33,230(1989))、qbend10(fina等,血液,75,2417(1990))、cd34(ab-1)(oncogene sciences)、immu-133(barrande等,杂交瘤(hybridoma),12,203(1993)等是已知的,可分离这些抗体基因用于生产。
不仅可采用h链和l链的组合,也可仅采用h链的肽或l链的肽。这些抗体种类可根据它们的应用来选择。可通过结合强度、抗原性等进行选择。
单链抗体的氨基酸序列见序列表中的序列号9和10。此外,编码这些抗体的核酸序列的例子和氨基酸序列一同显示。在序列表的序列号9中,第1-22位氨基酸是含有大肠杆菌分泌信号的序列,第23-133位氨基酸是l链的可变区,第134-148位氨基酸是接头,第149-266位氨基酸是h链可变区,第267-305位氨基酸是含有flag标签(第270-277位氨基酸)、c-myc标签(第281-290位氨基酸)和his×6标签(第296-301位氨基酸)的序列。在序列表的序列号10中,第1-22位氨基酸是含有大肠杆菌分泌信号的序列,第23-140位氨基酸是h链可变区,第141-155位氨基酸是接头,第156-266位氨基酸是l链可变区,第267-305位氨基酸是含有flag标签(第270-277位氨基酸)、c-myc标签(第281-290位氨基酸)和his×6标签(第296-301位氨基酸)的序列。
通过缺失序列表的序列号9和10中所述氨基酸序列的第1-20位氨基酸,单链抗体可在大肠杆菌中表达。序列表的序列号9和10中所述氨基酸序列的第267-305位氨基酸是用于检测和纯化单链抗体的序列,它可缺失或用任何序列替代。含有大肠杆菌分泌信号和检测和纯化序列的载体的制备见参考实施例2。序列表的序列号9所述第134-148位氨基酸序列中的接头和序列表的序列号10所述第141-155位氨基酸序列中的接头可用任何序列替代,只要l链和h链可变区的空间构型保持与4h5抗体基本相同即可。序列表的序列号9和10中氨基酸序列第305位的lys残基在该抗体固定化于水不溶性载体上时有效发挥作用以调整单链抗体分子的定向。为了增加固定化效率,可导入多个lys残基。导入cys残基也是有效的。上述修饰可采用遗传工程技术容易地进行。
在实施本发明时,插入表达质粒pg1的恒定区基因是cγ1,因此每一个克隆均表达成igg1。在生产抗体时,为避免来自血清的牛抗体的污染,培养期望在无血清dmem培养基中进行。用该方式分泌在培养基上清中的抗cd34抗体可用普通igg抗体的纯化方法容易地纯化,如使用a蛋白或g蛋白。作为工业生产的宿主,cho细胞和骨髓瘤sp 2/0细胞是人们熟知的(xiang,j.等(1990)分子免疫学(mol.immun.),27,809;bebbington,c.r.等(1992)bio/technology,10,169;larrick,j.w.和wallace,e.f.等(1992)免疫学评论(immunol. rev.)130,69-85;deyev,s.m.和lieber,a.等(1994)appl.biochem.biotechnol.47(2-3),143-54)。
例如,对于cho细胞,已报道了用试剂如mtx筛选具有高产量的克隆的方法(bebbington,c.r.(1991)方法酶学方法手册,2(2),136-45)。如果可获得稳定高产株系,则可将该株系用于重组抗人cd34抗体的工业生产。
作为抗体的构型,可使用产生的抗体分子本身。也可使用含有通过用各种蛋白酶处理获得的抗原结合位点的片段fab、f(ab')2、fv、fd等。这些片段在例如“抗体工程导论(introduction to antibodyengineering)”(chijinshokan)等中有解释。此外,当本发明用于人体血液体外循环时,考虑到抗体在血液中释放的副作用和抗原性,使用可变区之外的部分由人抗体组成的嵌合抗体是有用的。制备抗体的方法没有特别限制,但必需使用纯化至高纯度的抗体。产生单克隆抗体的方法可以是在鼠腹腔中增殖杂交瘤、从腹水中回收产生的抗体的常用方法或从无血清培养基的培养物上清获得抗体的方法。对于打断的肽,它们可通过抗体分子的酶处理获得。然而,它们也可采用遗传工程技术从细菌、酵母等产生。联合这些方法获得的单克隆抗体、来自单克隆抗体的抗体片段、肽等可获得更强的结合能力。
cd34分子已由civin等报道(美国专利4,965,204和免疫杂志,133,157(1984)),已知是未分化血细胞上特异表达的未分化细胞抗原标志,而且还报道了它们在分离未分化细胞中的应用(s.sealed等,血液,72,1580(1988),等)。而且,使用生物素、抗生物素蛋白或与磁珠结合,人们正在开发将未分化细胞与分化细胞和癌细胞群体分离的医学设备(dragger等,exp.hematol.23,147(1995))。
通过本发明分离的未分化造血细胞(cd34阳性细胞)是指那些可通过特定刺激增殖并可分化成至少一种成熟细胞如血红细胞、单核细胞、粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的细胞。特别地,它们包括在适当增殖因子存在下于半固体培养基中培养时形成集落的未分化血细胞和具有所有类型细胞分化潜能和自增殖潜能的造血干细胞。这些细胞在骨髓和脐带血中含量丰富。这些细胞也含于外周血中,但它们可通过施用细胞因子如粒细胞集落刺激因子(g-csf)在外周血中诱导。通过培养这些细胞在体外增殖未分化造血细胞的技术的报道越来越多。含有这些未分化造血细胞的细胞悬液可用作本发明分离未分化造血细胞的材料。
本发明分离细胞的设备可用作医学设备进行未分化造血细胞的分离。未分化造血细胞可从体外血细胞悬液或体外循环血液中有效分离,分离的细胞可用于治疗各种疾病。
从含有各种细胞种类的溶液如血液中分离或浓缩需要的未分化造血细胞或除去不需要的细胞是增加医疗效果的有效方法。骨髓移植是给骨髓破坏的癌症患者如白血病患者和先天性免疫疾病如再生障碍性贫血患者移植正常未分化造血细胞的方法,它正在成为这些患者的有效治疗手段。近来使用的方法不仅从骨髓而且也从外周血和脐带血获得未分化造血细胞。同种异体骨髓移植是从健康人获取的骨髓液灌输给骨髓已被抗癌剂或辐射破坏的患者的方法。在这种情况下,健康人与患者具有基本相同的hla类型即白细胞类型。该方法具有引起gvhd(移植物抗宿主病)即排斥的问题。因此,近年来,为了避免在造血系统恶性肿瘤或癌症的治疗中进行自身骨髓移植或同种异体骨髓移植产生的移植物抗宿主病(gvhd),分离未分化造血细胞的要求日益增加。
本发明的一个特征是使用重组抗体。使用重组抗体可将抗体修饰成容易在不溶性载体上固定化的抗体。通过向构成抗体的肽的c端或n端添加氨基酸序列,抗体可有效固定化于基质如不溶性载体的表面上。
对于人-鼠嵌合抗体,作为天然抗体h链和l链的c端或n端或其组合不包含的序列,可插入含有碱性或酸性氨基酸的氨基酸序列。当fc部分的中间序列通过遗传修饰将有关氨基酸转化成碱性或酸性氨基酸时,含有修饰部分的c端一侧可被视为加入的氨基酸序列。对于制造分离装置,制备能容易地与不溶性载体结合的fc区是适当的,这不限于人-鼠嵌合抗体。
在单链抗体中,期望在该肽的c端或n端加入用于将肽固定化于基质上的序列。
作为在序列中加入的氨基酸,期望含有碱性氨基酸或酸性氨基酸的序列。然而,本发明可包含任何氨基酸,只要该氨基酸旨在将抗体固定化于基质上即可。
对于碱性氨基酸,可列举赖氨酸、羟赖氨酸、精氨酸、组氨酸等。对于酸性氨基酸,可列举天冬氨酸、谷氨酸等。特别地,使用赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸更为有效。
序列长度没有特别限制。加入单氨基酸如赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等也是有效的。然而加入多个这种氨基酸的序列更为有效。在向低分子量抗体如单链抗体插入氨基酸时,对于基质固定化后抗体与抗原的结合,插入相对长的序列可降低空间阻碍,所以分离装置可望更有效。
加上了本发明序列的抗体使用于检测的色素容易结合,以便对与抗原结合的抗体的检测得以检测和分析抗原。
附图的简要描述图1是阐述igg结构的示意图。
图2是阐述质粒pg1的示意图。
图3是阐述质粒p3e380scfv的示意图。
图4是阐述质粒pet24scfv的示意图。
图5阐述4h5抗体和mt310抗体的抗原结合亲和力,在elisa中抗体浓度和测定值(abs)相关。
图6阐述嵌合抗体对kg 1a细胞的结合能力。(1)代表鼠cd34抗体起反应的阳性对照,(2)说明重组抗体可染色cd34阳性细胞kg 1a细胞,其中与阴性对照白色峰相比,黑色峰表示染色。
实施本发明的最佳方式下面,本发明将用实施例来描述,它们通过具体实例进一步解释本发明。然而本发明不应理解为受此限制。[参考实施例1]制备质粒pg1。除去表达载体pse(国际公布wo 95/15393)中膜结合型抗体的跨膜区(tm)以制备能分泌和表达人抗体的载体。首先用限制酶sali消化表达载体pse以制备切割的平末端。该反应用dna平端化试剂盒(dna blunting kit,takara shuzo)根据试剂盒手册进行操作。上述处理后的表达载体pse用限制酶apai消化,在0.7%琼脂糖凝胶上电泳以提取和纯化缺失了含有cγ1基因和跨膜区(tm)的基因区的pse载体dna。该反应使用genecleanii试剂盒(bio 101)根据试剂盒手册进行操作。限制酶切割的提取的pse载体的末端用牛碱性磷酸酶(takara shuzo)处理,使自连接不能发生。然后,用限制酶kpni(takarashuzo)消化含有全长人cγ1基因的质粒dna puccg1,并将切割末端制成平端。此后,用限制酶apai消化。消化产物在0.7%琼脂糖凝胶上电泳以提取和纯化含有全长cγ1的dna片段。将该dna片段和前面处理的pse载体用连接试剂盒第二版(takara shuzo)连接,连接产物导入大肠杆菌dh5株系中。从出现的菌落中选择并培养若干菌落,用传统方法提取和纯化质粒dna。用pse载体中存在的适当限制酶检查这些质粒的切割模式,选择一个模式符合期望模式的质粒。上述操作获得的质粒命名为pg1。图2是阐述pg1质粒的图。[参考实施例2]作为产生单链抗体(scfv抗体)的载体,在导入抗cd4抗体基因之前制备含有大肠杆菌分泌信号和用于纯化和检测的标签编码序列的质粒。大肠杆菌分泌信号通过等量混合序列表中的序列号21(5’tcatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgcggcccag3’) 和序列号22(5'tgcggccgcagccatggtgtttgcggccatcgccggctgggccgcgaggagcagca3’)两种序列获得。将混合物在94℃热变性5分钟,然后在65℃退火5分钟。之后,采用geneamp pcr试剂盒和amplitaq dna聚合酶(takara shuzo)(一种聚合酶)在72℃进行延伸反应10分钟。用ta克隆试剂盒(invitrogen)克隆该片段。这样就获得了编码大肠杆菌分泌信号的cdna。
用于纯化和检测的标签的编码序列通过等量混合序列表中的序列号23(5'tgcggccgcagactacaaggatgacgatgacaaaggctcgagcgagcagaagctga 3')和序列号24(5'ggtgggtcgacctcgagcccagatcctcttcgctgatcagcttctgctcgctcgagc 3')获得。将混合物在94℃热变性5分钟,然后在60℃退火5分钟。之后,采用geneamp pcr试剂盒和amplitaq dna聚合酶(takara shuzo)(一种聚合酶)在72℃进行延伸反应10分钟。使用反应后的样品作为模板,采用下列引物进一步进行pcr反应。用ta克隆试剂盒(invitrogen)克隆该扩增片段。这样就获得了用于纯化和检测的该标签的编码cdna。所用引物是序列表中的序列号25(5'tgcggccgcagactacaaggatg3')和序列号26(5'taagcttatcatttggtcgacccgtggtgatgatgatggtgggtcgacctcgagcc3')。pcr条件是使用geneamp pcr试剂盒和amplitaq dna聚合酶(takara shuzo),每个循环为94℃1分钟、62℃1分钟、72℃1分钟,重复18个循环。所用的pcr设备型号是dna热循环仪480(dna thermal cycler 480,perkin elmer)。对于克隆的基因,编码大肠杆菌分泌信号的cdna用限制酶bsphi(newengland biolabs)和noti(takara shuzo)消化,而用于纯化和检测的标签的编码cdna用限制酶hindhi(takara shuzo)和noti(takara shuzo)消化,然后在3.5%琼脂糖凝胶中电泳,切割并提取各dna片段。从琼脂糖凝胶提取dna片段是用pcrprep(promega)进行的。
pet24d( )质粒(novagen)首先除去从限制酶noti位点到限制酶bpu1102i位点的多克隆位点部分。用限制酶noti(takara shuzo)和限制酶bpu1102i(takara shuzo)消化质粒pet24d( ),用klenow片段(newenglandbiolabs)和dntp混合物(takara shuzo)按试剂说明书进行末端平端化。质粒片段在1%琼脂糖凝胶中电泳,切下和提取。这样可进行自连获得除去限制酶位点的pet24d( )质粒。对于自连,使用第2版连接试剂盒(ligation ver.2 kit,takara shuzo)。对于从琼脂糖提取dna片段,使用genecleanii试剂盒(bio 101)。
pse380质粒(invitrogen)或已除去上述限制酶位点的pet24d( )质粒用限制酶ncoi(takara shuzo)和hindhi(takara shuzo)消化,并在0.8%琼脂糖凝胶上电泳。由此提取和纯化载体dna片段。将用上述限制酶消化的编码大肠杆菌分泌信号的cdna和用于纯化和检测的标签的编码cdna连入载体片段。对于每个连接,使用第2版连接试剂盒(takarashuzo)。从琼脂糖凝胶提取dna片段也是用genecleanii试剂盒(bio 101)进行的。
用上述操作制备的产生scfv抗体的质粒载体分别称为pse380scfv和pet24scfv。图3和4显示了它们的示意图。[实施例1]
为了评价各种抗体和人cd4之间的结合亲和力,制备和纯化人可溶性cd4。从健康人收集15ml外周血,用hanks平衡生理盐水(gibco)制成30ml。向两个已各加入了10ml ficoll-paque(phamacia)的离心管缓慢覆盖13ml等分试样,在800 rpm条件下离心20分钟进行分离。回收单核细胞层的细胞。将回收的细胞用hanks溶液洗涤。用quickprep mrna纯化试剂盒(quickprep mrna purification kit,pharmacia)根据其手册从获得的1×107细胞分离mrna。使用分离的mrna作为模板合成cdna第一链。这采用cdna合成试剂盒(cdnasynthesis kit,pharmacia)按照附带手册进行。然后,用pcr方法扩增从起始密码子到跨膜区(tm)之前的靶基因,同时在5’端加上hindiii位点,在3’端加上flag标签序列、终止密码子和noti位点。所用引物是序列表中的序列号11(5'aagcttatgaaccggggagtccctttta3')和序列号12(5'gcggccgctcacttgtcatcgtcgtccttgtagtctggctgcaccggggtggacca 3')。
pcr条件是使用geneamp pcr试剂盒和amplitaq dna聚合酶(takara shuzo),每个循环为94℃1分钟、57℃1分钟、72℃1分钟,重复30个循环。所用的pcr设备型号是dna热循环仪480(perkinelmer)。扩增基因片段用ta克隆试剂盒(invitrogen)进行克隆。采用1.2.0版x373a型dna测序仪(dna sequencer ver.1.2.0,model x373a,applied biosystems)按照厂家手册进行核苷酸序列测定。使用m13反向引物(invitrogen)或通用m13正向引物(invitrogen)作为引物,采用prismreadv reaction dye deoxy terminator cycle测序试剂盒(appliedbiosystems)进行标记反应。所用方法按照试剂盒附带手册进行。证实获得的基因序列之后,用限制酶hindiii(takara shuzo)和noti(takarashuzo)消化真核表达载体pcdna3质粒(invitrogen)和含有人可溶性cd4cdna的克隆质粒,用传统方法在琼脂糖凝胶上电泳,然后提取和纯化载体和人可溶性cd4 cdna。该反应用genecleanii试剂盒(bio 101)按照附带手册进行。两个dna用连接试剂盒2.0版(takara shuzo)进行连接,连接的产物导入大肠杆菌dh5株系中。从出现的菌落选择并培养若干菌落,然后用传统方法提取和纯化质粒dna。用pcdna3中存在的适当限制酶检查质粒的消化模式,选择消化模式与期望模式相同的质粒。
然后,用deae葡聚糖法(bebbington,c.r.(1991);方法酶学方法指南,2(2),136-45)将获得的人可溶性cd4表达质粒导入cos7细胞。在导入基因之前4天,将cos7细胞在含10%胎牛血清(fbs)的dulbecco's modified eagle's medium(dmem)中重新接种至约6.1×105细胞/10ml/100mm培养皿,并培养。4天后,首先,除去上清液,用pbs(-)轻轻洗涤细胞,加入4ml含10%fbs的dmem。然后将dead葡聚糖/人可溶性cd4表达质粒混合物均匀喷洒在细胞上,将细胞在37℃孵育4小时。所用混合物通过以2∶1(v/v)比例混合20mg/ml deae葡聚糖(pharmacia)水溶液和溶于tbs(-)(20mm tris-hci(ph7.4),0.15mnacl)的0.17ug/ul人可溶性cd4表达质粒来制备。该混合物的加入量为180ul/培养皿。孵育后,丢弃上清液,加入5ml含10%二甲亚砜(dmso)pbs(-),放置1分钟。然后,丢弃上清液,剩余物用pbs(-)洗涤,加入7ml含100um氯奎(sigma)并添加了2%fbs的dmem,将混合物在37℃孵育3小时。之后,丢弃上清液,剩余物用pbs(-)洗涤,加入10ml含2%fbs的dmem,培养细胞。第二天,用pbs(-)和dmem充分除去含fbs的dmem,并加入10ml无血清dmem,开始生产。
生产之后3天,回收培养物上清,然后生产持续约2周。收集获得的培养物上清液,用抗flag-m2凝胶(eastman chemical)柱层析纯化,获得人可溶性cd4的纯化制品。[实施例2]将产生抗人cd4抗体的杂交瘤4h5(保藏号ferm bp-6729)在含10%fbs(icn)的dmem(gibco)培养基中培养。首先,用有限稀释法从杂交瘤分离克隆,采用固定化人可溶性cd4(repligen)的elisa方法处理培养物上清以选择对人可溶性cd4具有高结合能力的克隆。用quickprep mrna纯化试剂盒(pharmacia)根据附带手册从获得的1×107细胞分离mrna。使用分离的mrna作为模板合成cdna第一链。这采用cdna合成试剂盒(pharmacia)按照附带手册进行。然后,以上述获得的cdna为模板用pcr方法扩增靶基因。
对于h链的获得,使用鼠ig-prime试剂盒(novagen)作为引物,从分别具有序列表中的序列号13(5'gggaattcatgraatgsasctgggtywtyctctt3')和序列号14(5'cccaagcttccagggrccarkggataracngrtgg 3')之序列的引物扩增所述基因。pcr条件是使用geneamp pcr试剂盒和amplitaq dna聚合酶(takara shuzo),每个循环为94℃1分钟、50℃1分钟、72℃2分钟,重复30个循环。所用的pcr设备型号是dna热循环仪480(perkinelmer)。扩增基因片段用ta克隆试剂盒(invitrogen)进行克隆。
对于l链的获得,预先使用蛋白质测序仪(applied biosystems,492protein sequencer)按附带手册从n端测定l链n端15个残基的氨基酸序列。作为有义引物,合成一组可编码n端氨基酸序列的核苷酸序列。作为反义引物,参考“免疫学上有用蛋白质的序列”(sequences ofproteinsof immunological interest)(第5版,1991,美国nih出版)中所述鼠抗体可变区的基因序列合成一组可合成鼠抗体基因cdna的候选序列。联合使用有义和反义引物进行pcr方法。从分别具有序列表中的序列号15(5'tgtgccctcgagctnacncaragyccngc3')和序列号16(5'atggatactagtggtgcagcatcagccc3')之序列的引物扩增l链的可变区基因(部分长度)。pcr条件是使用geneamp pcr试剂盒和amplitaq dna聚合酶(takara shuzo),每个循环为94℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟,重复30个循环。所用的pcr设备型号是dna热循环仪480(perkin elmer)。扩增基因片段用ta克隆试剂盒(invitrogen)进行克隆。
采用1.2.0版1373型dna测序仪(dna sequencer ver.1.2.0,model1373,applied biosystems)按照厂家手册测定所获得基因的可变区(部分长度)h链和l链的核苷酸序列。使用通用m13反向引物(invitrogen)或通用m13正向引物(invitrogen)作为引物,采用prism ready reactiondye deoxy terminator cycle sequencing试剂盒(applied biosystems)进行标记反应。所用方法按照试剂盒附带手册进行。用abi标记试剂盒进行标记。
另外,对于l链的获得,再次通过pcr方法扩增靶基因以获得n端部分中尚未获得的区域。作为引物,采用鼠ig-prime试剂盒(novagen)和与获得的l链“cd-3”cdna互补的碱基链序列,并从分别具有序列表中的序列号17(5'-gggaattcatggagacagacacactcctgctat3')和序列号18(5'cgtcggaggatcctcactact3')之序列的引物扩增基因。pcr条件是使用geneamp pcr试剂盒和amplitaq dna聚合酶(takarashuzo),每个循环为94℃1分钟、50℃1分钟、72℃2分钟,重复30个循环。所用的pcr设备型号是dna热循环仪480(perkin elmer)。扩增基因片段用ta克隆试剂盒(invitrogen)进行克隆。同样,测定l链可变区(n端部分)的核苷酸序列。利用前面已克隆在pcr2.1(ta克隆试剂盒附带)上的l链可变区中的限制酶pflmi位点和hindiii位点,将l链的可变区(n端部分)和l链可变区(部分长度)的基因重组构建l链可变区(全长)的基因片段。限制酶pflmi来自new englandbiolabs,限制酶hindiii来自takara shuzo。在琼脂糖凝胶上电泳后提取和纯化用gene cleanii试剂盒(bio 101)按附带手册进行。对于两个dna的连接,使用连接试剂盒第2版(takara shuzo)。
通过上述操作测定的4h5抗体h链可变区(全长)基因序列及其氨基酸序列见序列号37,而通过上述操作测定的l链可变区(全长)基因序列及其氨基酸序列见序列号38。[实施例3]将实施例2中获得的含有抗人cd4抗体(4h5抗体)h链(第4-8位氨基酸)和l链(第4-111位氨基酸)可变区的核苷酸序列的基因片段插入pg1质粒,以制备能表达抗人cd4人-鼠嵌合抗体的质粒。使用含有h链可变区基因片段的克隆的质粒dna作为模板,并使用分别具有序列表中的序列号19(5-caggatccgctgcagcagtctggacct3')和序列号20(5'tgggcccgtcgttttggctgcagagac3')之序列的引物,用pcr法制备具有新导入的apai和bamhi限制酶位点的h链可变区片段。pcr条件是使用geneamp pcr试剂盒和amplitaq dna聚合酶(takara shuzo),每个循环为94℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟,重复30个循环。所用的pcr设备型号是dna热循环仪480(perkinelmer)。扩增基因片段用ta克隆试剂盒(invitrogen)进行克隆。用限制酶apai(takara shuzo)和bamhi(takara shuzo)消化含有h链(第4-118位氨基酸)可变区核苷酸序列的dna片段后,将产物通过电泳在2%的琼脂糖凝胶上分离,切割凝胶并提取。从电泳琼脂糖凝胶提取dna片段使用gene cleanii试剂盒(bio 101)按照附带手册进行。
然后,用限制酶apai和bamhi消化载体pg1,然后与用0.7%琼脂糖凝胶相似电泳分离、切割和提取的片段连接。连接产物导入大肠杆菌jm109株中。连接反应用连接试剂盒第2版(takara shuzo)进行。将转化的大肠杆菌细胞接种在含氨苄青霉素的lb平板上,培养过夜。从出现的菌落选取若干菌落,用传统方法提取和纯化质粒dna。用插入时所用的限制酶即限制酶apai和bamhi消化这些质粒,选择一个插入了含有h链可变区核苷酸序列的片段的质粒。之后,对于l链,用限制酶xhoi(takara shuzo)和spei(takara shuzo)消化在实施例2中获得的克隆的质粒dna(含有l链(第4-111位氨基酸)可变区核苷酸序列的基因片段),所述克隆的基因是用分别具有序列表中的序列号13(5'tgtgccctcgag ctnacncaragyccngc3')和序列号14(5'atggatactag tggtgcagcatcagccc3')之序列的引物扩增的。之后,消化产物在1%琼脂糖凝胶上电泳分离,切割凝胶并提取含有l链可变区核苷酸序列的dna片段。从电泳琼脂糖凝胶提取dna片段使用gene cleanii试剂盒(bio 101)按照附带手册进行。然后用限制酶xhoi和spei消化已插入了含有h链可变区核苷酸序列的dna片段的载体pg1,并与相似地用0.7%琼脂糖凝胶电泳分离、切割和提取的片段连接。连接产物导入大肠杆菌jm109株中。连接反应用连接试剂盒第2版(takara shuzo)进行。将转化的大肠杆菌细胞接种在含氨苄青霉素的lb平板上,培养过夜。从出现的菌落选取若干菌落,用传统方法提取和纯化质粒dna。用插入限制酶即限制酶xhoi和apai消化这些质粒,选择一个插入了含有h链和l链可变区核苷酸序列的片段的质粒。通过上述方法获得的分泌型抗体表达质粒称为pg14h5。[实施例4]用deae葡聚糖法(bebbington,c.r.(1991);方法酶学方法指南,2(2),136-45)将实施例3中获得的分泌型抗体表达质粒pg14h5导入cos7细胞。在导入基因之前4天,将cos7细胞在含10%胎牛血清(fbs)的dulbecco's modified eagle's medium(dmem)中重新接种至约6.1×105细胞/10ml/100mm培养皿,并培养。4天后,首先,除去上清液,用pbs(-)轻轻洗涤细胞,加入4ml含10%fbs的dmem。然后将deae葡聚糖/分泌型抗体表达质粒混合物均匀喷洒在细胞上,将细胞在37℃孵育4小时。所用混合物通过以2∶1(v/v)比例混合20mg/ml deae葡聚糖(pharmacia)水溶液和溶于tbs(-)(20mm tris-hci(ph 7.4),0.15mnacl)的0.17ug/ul分泌型抗体表达质粒来制备。该混合物的加入量为180ul/培养皿。孵育后,丢弃上清液,加入5ml含10%二甲亚砜(dmso)的pbs(-),放置1分钟。
然后,丢弃上清液,剩余物用pbs(-)洗涤,加入7ml含100um氯奎(sigma)并添加了2%fbs的dmem,将混合物在37℃孵育3小时。之后,丢弃上清液,剩余物用pbs(-)洗涤,加入10ml含10%fbs的dmem,培养细胞。第二天,用pbs(-)和dmem充分除去含fbs的dmem,并加入10ml无血清dmem,开始生产。
生产之后3天,回收培养物上清,然后生产持续约2周。收集获得的培养物上清液,用g蛋白sepharose柱层析纯化,获得人-鼠嵌合抗cd4抗体的纯化制品(下面称为嵌合4h5抗体)。[实施例5]
采用superdex200凝胶过滤柱(pharmacia)和smartsystem(pharmacia)将实施例1中制备的人可溶性cd4进行缓冲液置换,置换成10mm乙酸缓冲液(ph=5.0)。以5ul/min速度向传感芯片cm5(pharmacia)的不同道供给人可溶性cd4溶液(250ug/ml,20ud,以便可通过胺偶联法固定化,获得人可溶性cd4固定化传感芯片。
采用superdex200凝胶过滤柱(pharmacia)和smartsystem(pharmacia)将(实施例4中制备的)4h5抗体或嵌合4h5抗体进行缓冲液置换,置换成hbsbuffer(pharmacia)。使用bia-core 2000(pharmacia),在预先制备的人可溶性cd4固定化传感芯片上以5ul/min速度向每一道供给作为分析物的4h5抗体溶液或嵌合4h5抗体溶液(50ug/ml,20ul),以获得结合的传感图。然后,仅为传感芯片每一道以5ul/min速度供给hbsbuffer,获得解离的传感图。传感图的分析给出人可溶性cd4和抗人cd4抗体的解离常数(kd该值越低,则结合亲和力越高)。结果,4h5抗体对人cd4抗原的解离常数是kd=8.08×10-10m(kon=6.60×103m-1s-1,koff=5.33×10-6s-1)。嵌合4h5抗体的解离常数是kd=1.24×10-9m(kon=2.36×104m-1s-1,koff=2.92×10-5s-1)。这揭示它们强烈结合人cd4抗原。[实施例6]获得可用于嵌合4h5抗体工业生产的稳定高产菌株。作为用于工业生产的宿主,cho细胞和骨髓瘤sp 2/0细胞是人们熟知的(xiang,j.等(1990)分子免疫学(mol.immun.),27,809;bebbington,c.r.等(1992)bio/technology,10,169;larrick,j.w.和wallace,e.f.等(1992)免疫学评论(immunol.rev.)130,69-85;deyev,s.m.和lieber,a.等(1994)appl.biochem.biotechnol.47(2-3),143-54)。例如,对于cho细胞,已报道了用试剂如mtx筛选具有高产量的克隆的方法(bebbington,c.r.(1991)方法酶学方法指南,2(2),136-45),并且参考上述方法获得了产生嵌合4h5抗体的稳定高产菌株。
方法是,在用于电穿孔的缓冲液(272mm蔗糖,7mm磷酸盐缓冲液,1mm mgcl2,ph=7.4)中将chodhfr株(atcc crl-9096)调节至1.0×107细胞/ml,取500ul加入电穿孔用小杯(bio-rad)中,冰浴冷却。向其中混合10ug实施例3中制备的pg14h5和1ug质粒psv2dhfr(atcc no.37146),将混合物冰冷5分钟。对该混合物应用3uf、0.55kv的电脉冲,将混合物冰冷1分钟。再次对该混合物应用3uf、0.55kv的电脉冲,将混合物冰冷5分钟。电脉冲的加载通过使用bio-rad的基因脉冲仪来实现。将细胞转移至在f12培养基(gibco)中加入10%fbs制备的10ml培养基中,在100mm组织培养皿(falcon)中5%co2、37℃培养过夜。用胰蛋白酶-edta溶液(gibco)从培养皿分离细胞,转移至120ml在dmem培养基(gibco)中添加10%透析过的fbs(gibco)制成的培养基中,接种至4个150mm组织培养皿中。将培养基每2或3天用相同培养基更换。经过约2周,集落形成的程度可用肉眼观察到。
分离数十个集落,将每一个在添加了20nm mtx(amethopterin;sigma)的dmem培养基 10%透析fbs(gibco)中培养。将培养基每2或3天用相同培养基更换,持续培养1个月。将每个获得mtx药物抗性的克隆(能在相同培养基中增殖的克隆)在添加了100nm mtx的dmem 10%透析fbs(gibco)培养基中培养。将培养基每2或3天用相同培养基更换,持续培养1个月。最后,采用用于igg1的人免疫球蛋白g(igg)亚型eia试剂盒(the binding site)测定获得100nm mtx药物抗性的克隆(能在相同培养基中增殖的克隆)在培养基上清中的嵌合4h5抗体的浓度。然后选择产生嵌合4h5抗体的稳定高产菌株。通过上述技术,建立了一个以5ug/106细胞/天速度产生嵌合4h5抗体的稳定表达菌株。[实施例7]为了将抗体基因插入产生scfv抗体的载体中,通过pcr法使用含有限制酶序列和接头序列的引物扩增实施例2中获得的在序列号37和38中描述的基因。作为l链的引物,使用序列表的序列号27(5'agccggccatggccgacattgtgctgaccc aatctcca3′)和序列号28(5'ctccggagccacctccgcctgaaccgcctccacctttgatttccagcttggtgcctcc3')的序列,而作为h链的引物,使用序列号29(5'ctccggaggtggcggatcgcaggttcagctgcagcagtct3')和序列号30(5'tgcggccgctgcagagacagtgaccagagtc3')的序列。pcr条件是使用geneamp pcr试剂盒和amplitaq dna聚合酶(takarashuzo),每个循环为94℃45秒、58℃45秒、72℃1分钟,重复18个循环。所用的pcr设备型号是dna热循环仪480(perkin elmer)。扩增基因片段用ta克隆试剂盒(invitrogen)进行克隆。用限制酶naei(takarashuzo)和mroi(toyobo)消化基因的l链,用限制酶mroi(toyobo)和noti(takara shuzo)消化基因的h链,然后在2%琼脂糖凝胶上电泳。切割和提取含有相应dna片段的凝胶部分。从琼脂糖凝胶提取dna片段使用gene cleanii试剂盒(bio 101)。
在用限制酶naei(takara shuzo)和noti(takara shuzo)消化参考实施例2中制备的pse380scfv或pet24scfv载体后,将产物在1%琼脂糖凝胶上电泳,切割和提取含有相应dna片段的凝胶部分。将其与上述用限制酶消化的l链和h链dna片段连接。连接用连接试剂盒第2版(takara shuzo)进行。从电泳琼脂糖凝胶提取dna片段使用genecleanii试剂盒(bio 101)。将上述方法获得的质粒导入大肠杆菌dh5株系中。pse380scfv载体的转化大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的lb平板上,而pet24scfv载体的转化大肠杆菌接种在含卡那霉素的lb平板上,培养过夜。从出现的菌落选择若干菌落,用传统方法提取和纯化质粒dna。用适当限制酶检查质粒的消化模式,选择消化模式与期望模式相同的质粒。通过上述操作获得的表达具有抗cd4抗体序列的4h5scfv(n-端vl-接头-vh,c-端类型下文称为lh型)抗体的质粒命名为pse380scfv4h5lh或pet24scfv4h5lh。序列表中的序列号9显示了单链抗体(scfv4h5lh)氨基酸序列和编码它的一个核苷酸序列例子。[实施例8]
为了将抗体基因插入产生scfv抗体的载体中,通过pcr法使用含有限制酶序列和接头序列的引物扩增实施例2中获得的在序列号37和38中描述的基因。作为h链的引物,使用序列表的序列号31(5'agccggccatggcccaggttcagctgcag cagtct3')和序列号32(5'ctccggagccacctccgcctgaaccgcctccacctgcagagacagtgaccagagtc3')的序列,而作为l链的引物,使用序列号33(5'ctccggaggtggcggatcggacattgtgctgacccaatctcca3')和序列号34(5'tgcggccgctttgatttccagcttggtgcctcc3')的序列。pcr条件是使用geneamp pcr试剂盒和amplitaq dna聚合酶(takara shuzo),每个循环为94℃45秒、58℃45秒、72℃1分钟,重复18个循环。所用的pcr设备型号是dna热循环仪480(perkin elmer)。扩增基因片段用ta克隆试剂盒(invitrogen)进行克隆。用限制酶naei(takara shuzo)和mroi(toyobo)消化基因的h链,用限制酶mroi(toyobo)和noti(takara shuzo)消化基因的l链,然后在2%琼脂糖凝胶上电泳。切割和提取含有相应dna片段的凝胶部分。从电泳琼脂糖凝胶提取dna片段使用gene cleanii试剂盒(bio 101)。
在用限制酶naei(takara shuzo)和noti(takara shuzo)消化参考实施例2中制备的pse380scfv或pet24scfv载体后,将产物在1%琼脂糖凝胶上电泳,切割和提取含有相应dna片段的凝胶部分。将其与上述用限制酶消化的h链和l链dna片段连接。连接用连接试剂盒第2版(takara shuzo)进行。从电泳琼脂糖凝胶提取dna片段使用genecleanii试剂盒(bio 101)。将上述方法获得的质粒导入大肠杆菌dh5株系中。pse380scfv载体的转化大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的lb平板上,而pet24scfv载体的转化大肠杆菌接种在含卡那霉素的lb平板上,培养过夜。从出现的菌落选择若干菌落,用传统方法提取和纯化质粒dna。用适当限制酶检查质粒的消化模式,选择消化模式与期望模式相同的质粒。通过上述操作获得的表达具有抗cd4抗体序列的4h5scfv(n-端vh-接头-vl,c-端类型下文称为hl型)抗体的质粒命名为pse380scfv4h5hl或pet24scfv4h5hl。序列表中的序列号10显示了单链抗体(scfv4h5hl)氨基酸序列和编码它的一个核苷酸序列例子。[实施例9]将实施例7中转化了质粒pse380scfv4h5lh的大肠杆菌dh5株系在添加了100ug/ml氨苄青霉素和1%甘油的2×yt培养基(1.6%细菌用胰蛋白胨,1%细菌用酵母提取物,0.5%nacl)中培养。第二天,取一部分加至10倍量的上述培养基中。培养1小时后,丢弃上清液,培养基用等量添加了1mm iptg、100ug/ml氨苄青霉素和1%甘油的2×yt培养基更换。再培养3小时,然后将除去上清液的细胞悬浮在1/10倍培养物体积的冰冷tes(200mm tris-hcl(ph=8.0),0.5mm edta,0.5m蔗糖)溶液中。将该悬液在冰上放置10分钟,4℃以14,000rpm离心20分钟。丢弃上清液,剩余物悬浮在1/10倍培养物体积的冰冷te溶液(10mm tris-hcl(ph=8.0),0.5mm edta)中。将该悬液在冰上放置30分钟,4℃以14,000rpm离心20分钟以回收周质中的抗体。获得的粗抗体部分用抗flag-m2凝胶(eastman chemical)柱层析纯化,并用talon金属亲和凝胶(clontech)进一步纯化。柱层析按照各凝胶附带的手册进行。这就是抗人cd4单链抗体(scfv4h5lh)的纯化制品。
将实施例1中制备的人可溶性cd4的pbs(-)溶液(5.2ug/ml)按50ul/孔的量分加至聚苯乙烯96孔板的孔中,置于4℃过夜以使抗原固定化。丢弃上清液,用250ul含0.05%tween 20的pbs(-)(下文称为pbs-t)洗涤剩余沉淀。各孔加入100ul block ace(dainippon seiyaku),置于室温1小时以实施封闭。丢弃每孔的上清之后,沉淀用250ul pbs-t洗涤两次。丢弃上清液,加入上面制备的10ug/ml抗人cd4单链抗体的pbs(-)溶液,置于室温2小时进行反应。丢弃上清,剩余物用250ul pbs-t洗涤三次。丢弃上清之后,每孔加入50ul用pbs-t稀释1000倍的标记了辣根过氧化物酶的抗myc抗体(invitrogen),置于室温2小时。丢弃上清,剩余物用250ul pbs-t洗涤三次。丢弃上清,加入50ul通过向邻苯二胺(sigma)的pbs(-)溶液加入0.01%h2o2制备的显色试剂溶液,于室温反应7分钟。然后加入50ul 2n硫酸溶液以终止酶反应。测定490nm处平板的吸光度。测得的吸光度为0.574。重复相同实验,只是省略掉人可溶性cd4的固定化操作,获得的吸光度为0.109。这些结果表明抗人cd4单链抗体(5cfv4h5lh)识别人cd4,因而具有亲和力。[实施例10]将2-碘乙酰胺(tokyo kasei)(50g)悬浮在100ml蒸馏水中,加入20ml37%甲醛(wako pure chemicals industries,ltd.)。混合物在50℃搅拌溶解。缓慢加入25.2g碳酸钾,用搅拌器搅拌混合物10分钟,然后置于室温2小时。之后将混合物置于4℃过夜,再倒掉上清液。加入40ml蒸馏水,在50℃溶解沉淀,并将此溶液置于室温2小时,进一步于4℃过夜。再次重复该程序,获得的沉淀通过滤过g-3玻璃纤维(纤维直径30mmnippon rikagaku kikai有限公司)回收。用抽气器抽气干燥沉淀1小时,然后冰冻干燥24小时以制备n-羟甲基碘乙酰胺,后者是一种能被导入不溶性载体用于抗体固定化的活化基团。
在玻璃烧瓶中加入5.7ml硫酸、7.2ml硝基苯和0.0363g多聚甲醛,搅拌溶解。然后加入0.58g n-羟甲基碘乙酰胺,搅拌混合物。向上述混合物中加入0.3g聚丙烯无纺织物(平均纤维直径3.3um),使其于室温反应过夜。反应后,取出无纺织物,用纯水洗涤,真空干燥,获得导入了用于抗体固定化的活化基团的无纺织物。将该无纺织物切开置于0.7cm直径的圆盘上。在室温将4个圆盘在溶于pbs(-)的抗人cd4抗体(4h5抗体)溶液(17.7ug/400ul)中或抗人cd4单链抗体(scfv4h5lh)溶液(17.7ug/400ul)中浸泡2.5小时,以固定化抗体。2.5小时后,将它们用pbs(-)洗涤。在具有进口和出口的1ml容器中装入这4个圆盘,制成柱子。作为比较对照,制备一个以相同方式固定化了牛血清白蛋白(bsa;piercealbumin standard)而非抗体的柱子。
以实施例1相同方式通过用ficoll-paque(pharmacia)进行密度梯度离心从健康人血液回收单核细胞层细胞。回收的细胞用pbs(-)洗涤,并调节至1.2×106细胞/ml。用注射泵以1ml/min的流速加入4ml单核细胞悬液,从上述制备的柱子入口流入。处理后的液体从柱子的出口回收。用已知的流式细胞仪法(facs)测定cd4阳性细胞的比例。facs分析时用fitc标记的抗cd4抗体(fermingen)进行细胞染色,并用facscalibur(becton dickinson)测定。
表1显示了通过柱子之前或之后cd4阳性细胞和其它细胞(cd4阴性细胞)的比例。在本实施例中,通过4h5抗体固定化柱之后cd4阳性细胞的清除比例为100%,而通过scfv4h5lh固定化柱之后清除比例为99.9%。这些结果表明,与4h5抗体比较,就对cd4阳性细胞的结合亲和力和特异性而言,抗人cd4单链抗体(scfv4h5lh)与4h5抗体具有基本相同的功能。
表1
按如下方法获得4h5杂交瘤。
将血液覆盖在ficoll-high-paque上,离心后回收单核淋巴细胞层。接着,使用抗cd8抗体通过免疫沉淀法除去cd8阳性细胞,获得cd4淋巴细胞浓缩的部分。将该细胞部分用pha凝集素(e.y.laboratory)刺激制备用于免疫的细胞。细胞用dmem培养基(gibco)洗涤后,与佐剂tiler max(cytrx)混合,混合物经腹膜内途径给balb/c小鼠(japancharles river)施用并免疫,剂量为约2×107细胞/只鼠。从初次免疫开始,每2周进行一次加强免疫。初次免疫3个月之后,通过静脉注射施用以相同方式制备的细胞用于加强免疫。
将来自balb/c小鼠的骨髓细胞系ns1细胞系(atcc tib-18)在添加了20%fcs的dmem培养基(gibco)中继代培养。
将从上述免疫动物小鼠获得的脾脏解离,通过网格过滤同时用dmem培养基洗涤,离心分离脾细胞。将脾细胞和上述增殖的ns1细胞系混合,然后离心。向混合细胞中加入聚乙二醇(boehringer-mannheim)至终浓度30%,形成悬液。
离心分离细胞,缓慢分散在含20%胎牛血清的dmem组织培养基中(gibco),其中使用小鼠脾细胞作为饲养细胞。然后,将细胞以106细胞/100ul的数量接种至平底96孔微量滴定板(nunc)的孔中,在5%co2中37℃培养。
细胞融合1天后,加入100ul hat培养基(补充上述培养基以含有13.61ug/ml次黄嘌呤、3.88ug/ml胸腺嘧啶核苷和0.18m氨基喋呤)。以后3天,每天用新hat培养基更换约一半hat培养基。此后每2或3天以相同方式更换培养基。将杂交瘤克隆(融合细胞)培养于ht培养基(不含氨基喋呤的hat)中,并维持培养。
用有限稀释法继代培养几个上述杂交瘤细胞。用台盼蓝染料排斥法和血细胞计数器对杂交瘤细胞计数。以0.5细胞/100ul ht培养基的生长细胞比例将杂交瘤悬浮在ht培养基中,悬液以100ul/孔的量分开加入平底96孔微量培养板的孔中。每2或3天用新鲜培养基更换培养基以增殖杂交瘤。
用获得的杂交瘤培养物上清液与人淋巴细胞反应,以检测识别人淋巴细胞cd4阳性细胞的抗体。检测用facscan(becton dickinson)进行。通过该操作,从获得的抗体群中成功地得到了特异性和结合能力优异的4h5细胞。[实施例12]进行4h5抗体的生产和纯化。产生抗人cd4抗体的杂交瘤4h5(保藏号ferm bp-6729)在添加了10%胎牛血(fbs)(icn)的dmem培养基(gibco)中培养。首先,用有限稀释法从杂交瘤分离克隆,用固定化人可溶性cd4(repligen)的elisa方法处理培养物上清,以选择对人可溶性cd4具有高结合能力的克隆。将4h5杂交瘤克隆移植至balb/c小鼠腹腔内并增殖。获得的腹水采用a蛋白sepharose(pharmacia)亲和层析法纯化,以获得4h5抗体的纯化制品。[实施例13]将实施例1中制备的人可溶性cd4的pbs(-)溶液(5.2ug/ml)按50ul/孔的量分加至聚苯乙烯96孔板的孔中,置于4℃过夜以使抗原固定化。丢弃上清液,用250ul含0.05%tween 20的pbs(-)(下文称为pbs-t)洗涤剩余沉淀。各孔加入100ul block ace(dainippon seiyaku),置于室温1小时以实施封闭。丢弃每孔的上清之后,剩余物用250ul pbs-t洗涤两次。丢弃上清液,分别加入调节至各种浓度的4h5抗体(实施例12中制备,同种型为igg1-k)或mt310抗体(dacco,同种型为igg1-k)的pbs(-)溶液,置于室温2小时进行反应。丢弃上清,剩余物用250ul pbs-t洗涤三次。丢弃上清之后,每孔加入50ul用pbs-t稀释200倍的生物素标记的抗鼠igg(h l)抗体(vector),置于室温1小时。每孔丢弃上清后,剩余物用250ul pbs-t洗涤三次。丢弃上清,每孔加入50ul用pbs-t稀释100倍的vectastain elite标准试剂盒(vector)a溶液和b溶液的等体积混合物,于室温反应1小时。从每孔丢弃上清液后,剩余物用250ul pbs-t洗涤6次。丢弃上清,加入50ul通过向邻苯二胺(sigma)的pbs(-)溶液加入0.01%h2o2制备的显色试剂溶液,于室温反应3分钟。然后加入50ul 2n硫酸溶液终止反应。测定490nm处平板的吸光度。
图5说明所用抗体(4h5抗体或mt310抗体)浓度和吸光度之间的关系。它揭示4h5抗体比mt310抗体可检测更低浓度的cd4分子,并且比mt310抗体对人cd4分子具有更高的亲和力。[实施例14]采用superdex 200凝胶过滤柱(pharmacia)和smartsystem(pharmacia)将4h5抗体(实施例2中制备,同种型为igg1-κ)和13b8.2(imunotech,同种型为igg1-κ)进行缓冲液置换,置换成10mm乙酸缓冲液(ph=5.0)。以5ul/min速度向传感芯片cm5(pharmacia)不同道供给抗体溶液(100ug/ml,70ul),以便可通过胺偶联法固定化,获得抗人cd4抗体固定化传感芯片。其次,采用superdex 200凝胶过滤柱(pharmacia)和smartsystem(pharmacia)将(实施例1中制备的)人可溶性cd4进行缓冲液置换,置换成hbsbuffer(pharmacia)。使用bia-core 2000(pharmacia),在预先制备的抗体固定化传感芯片上以5ul/min速度向每一道供给作为分析物的人可溶性cd4(15.2ug/ml,20ul),以获得结合的传感图。然后,仅为传感芯片每一道以5ul/min速度供给hbsbuffer,获得解离的传感图。传感图的分析给出人可溶性cd4和抗人cd4抗体的解离常数(kd该值越低,则结合亲和力越高)。
结果,4h5抗体的解离常数是kd=1.71×10-9m(kon=1.35×105m-1s-1,koff=2.31×10-4s-1)。13b8.2抗体的解离常数是kd=7.58×10-9m(kon=1.82×104m-1s-1,koff=1.38×10-4s-1)。解离常数的比较揭示4h5抗体对人可溶性cd4的结合亲和力比13b8.2抗体高约4.4倍。[实施例15]产生含抗cd4抗体的稳定制品。通过凝胶过滤将实施例2获得的4h5抗体无菌置换为含100mm氯化钠的20mm磷酸盐缓冲液ph=7.4(pbs)。取1mg获得的4h5抗体和200mg人血清白蛋白与pbs混合配成2ml。将该溶液无菌注射至玻璃瓶中并密封。[实施例16]产生含人-鼠嵌合抗cd4抗体的稳定制品。通过凝胶过滤将实施例4获得的嵌合4h5抗体无菌置换为含100mm氯化钠的20mm磷酸盐缓冲液ph=7.4(pbs)。取1mg获得的嵌合4h5抗体和200mg人血清白蛋白与pbs混合配成2ml。将该溶液无菌注射至玻璃瓶中并密封。[实施例17]产生含单链抗cd4抗体的稳定制品。通过凝胶过滤将实施例9获得的抗人cd4单链抗体(scfv4h5lh)无菌置换为含100mm氯化钠的20mm磷酸盐缓冲液ph=7.4(pbs)。取500ug获得的单链抗体和200mg人血清白蛋白与pbs混合配成2ml。将该溶液无菌注射至玻璃瓶中并密封。[实施例18]为分离抗体基因,将杂交瘤抗my-10(atcc hb-8483)培养于添加了10%胎牛血清的rpmi-1640培养基(gibco)中。首先,用有限稀释法从杂交瘤分离克隆,并分析培养物上清以选择对人急性骨髓白血病细胞kg-1a具有高结合能力的克隆。用agpc法(chomczynski,p.和sacchi,n.(1987)用酸性硫氰酸胍-phoh-氯仿提取分离rna的一步法,分析生物化学(anal.biochem.),162,156-159)从获得的6×107细胞分离总rna。用quickprep mrna纯化试剂盒(pharmacia)从分离的rna进一步分离mrna。使用获得的mrna作为模板,合成cdna第一链。这采用cdna合成试剂盒(pharmacia)按照附带手册进行。
然后,用pcr方法扩增靶基因。作为引物,参考“免疫学上有用蛋白质的序列”(第5版,1991,美国nih出版)中所述鼠抗体可变区的基因序列合成一组可合成鼠抗体基因cdna的候选序列,组合这些引物进行pcr。从具有核酸序列(5' gtcccaggatcctctgaagcagtcaggccc3')和(5'acagtgggcccgtcgttttggctgaggaga3')的可获取h链的引物和具有核酸序列(5'tgtgccctcgaggtgactcaaactccactctc3')和(5'atggatactagtggtgcagcatcagccc3')的可获取l链的引物扩增基因。扩增基因片段用ta克隆试剂盒(invitrogen)进行克隆。采用1.2.0版373型dna测序仪(applied biosystems)按照附带手册测定所获得基因的h链和l链可变区的核苷酸序列。h链使用核苷酸序列(5'ctcttggaggagggtgccag3'),κ链使用核苷酸序列(5'ccagatttcaactgctcatcaga3')作为引物,采用prism readyreaction dye deoxy terminator cycle sequencing试剂盒(appliedbiosystems)进行标记反应。所用方法按照试剂盒附带手册进行。用abi标记试剂盒进行染色。结果,从h链引物获得的基因片段见序列号39,而从l链引物获得的基因片段见序列号40。[实施例19]将实施例18中获得的含有抗cd34抗体h链和l链可变区核苷酸序列的基因片段插入pg1质粒,以制备能表达抗cd34抗体的质粒。用限制酶xhoi(takara shuzo)和spei(takara shuzo)消化克隆质粒dna的l链后,将产物通过电泳在0.7%的琼脂糖凝胶上分离,切割凝胶并提取含有l链可变区核苷酸序列的dna片段。从电泳琼脂糖凝胶提取dna片段使用gene cleanii试剂盒(bio 101)按照附带手册进行。其次,用限制酶xhoi和spei消化载体pg1,与相似地用0.7%琼脂糖凝胶电泳分离、切割和提取的上述片段连接。然后,用限制酶apai(takara shuzo)和bamhi(takara shuzo)切割并提取含有h链可变区核苷酸序列的dna片段。从电泳琼脂糖凝胶提取dna片段使用gene cleanii试剂盒(funakoshi)按照附带手册进行。接着,在用限制酶apai和bamhi消化已按如上所述插入了含有h链可变区核苷酸序列的dna片段的载体pg1后,将消化产物与从0.7%琼脂糖凝胶电泳切割和提取的片段连接。连接产物导入大肠杆菌jm109株中。连接反应用连接试剂盒第2版(takarashuzo)进行。将转化的大肠杆菌细胞接种在含氨苄青霉素的lb平板上,培养过夜。从出现的菌落选取若干菌落,用传统方法提取和纯化质粒dna。用插入时使用的限制酶即限制酶xhoi和apai消化这些质粒,选择一个插入了含有h链和l链可变区核苷酸序列的片段的质粒。通过上述方法获得的分泌型抗体表达质粒命名为pg1my10。[实施例20]用deae葡聚糖法(bebbington,c.r.(1991);方法酶学方法指南,2(2),136-45)将实施例19中获得的分泌型抗体表达质粒pg1 my10导入cos7细胞。在导入基因的4天之前,将cos7细胞在含10%胎牛血清(fbs)的dulbecco's modified eagle's medium(dmem)中重新接种至约6.1×105细胞/10ml/100mm培养皿,并培养。4天后,首先,除去上清液,用磷酸盐缓冲盐(不含钙和镁)(pbs(-))轻轻洗涤细胞,加入4ml含10%fcs的dmem。然后将deae葡聚糖/分泌型抗体表达质粒混合物均匀喷洒在细胞上,将细胞在37℃孵育4小时。所用混合物通过以2∶1(v/v)比例混合20 mg/ml deae葡聚糖(pharmacia code no.170350-01,lot.pf97323)水溶液和溶于tbs(-)(20 mm tris-hci(ph 7.4),0.15m nacl)的0.17ug/ul分泌型抗体表达质粒溶液来制备。该混合物的加入量为180ul/培养皿。孵育后,丢弃上清液,加入5ml含10%二甲亚砜(dmso)的pbs(-)。混合物放置1分钟。然后,丢弃上清液,剩余物用pbs(-)洗涤,加入7ml含100 um氯奎(sigma,no.c6628)并添加了2%fbs的dmem,将混合物在37℃孵育3小时。之后,丢弃上清液,剩余物用pbs(-)洗涤,加入10ml含10%fcs的dmem,培养细胞。第二天,用pbs(-)和dmem充分除去含fcs的dmem,并加入10ml无血清dmem,开始生产。
开始生产之后3天,回收培养物上清,然后生产持续约2周。收集获得的培养物上清液,用g蛋白sepharose柱层析纯化,获得人-鼠嵌合抗cd34抗体的纯化制品。
该纯化制品对cd34抗原的结合通过下列方法证实。在1.5ml管中制备1×106培养细胞kg1a,用细胞悬液(加2%fcs的pbs(-))洗涤该管两次。向洗涤过的细胞加入50ul细胞悬液以悬浮细胞。再加入1ug纯化制品,将混合物置于冰上30分钟。之后,再用细胞悬液洗涤细胞3次。然后加入50ul细胞悬液以悬浮细胞。向其中加入1ug fitc标记的羊抗人igg(fc)抗体(1/20稀释,immunotec),将混合物置于冰上30分钟。之后,再用细胞悬液洗涤细胞3次。然后加入300ul细胞悬液以悬浮细胞。这样处理的细胞用流式细胞仪(becton dickinson)照射激光束,根据荧光测定细胞上结合的抗体效价。作为对照,加入1ug来自骨髓瘤的人igg抗体而不是纯化制品,细胞用上述相同操作处理。图6说明纯化制品对cd34抗原的结合。证实来自pg1my10的抗cd34抗体纯化制品具有对cd34抗原的结合活性,该人-鼠嵌合抗cd34抗体显示具有对cd34抗原的结合活性。还证实cd34阳性细胞可用本纯化制品检测。[实施例21]为了将抗体基因插入产生scfv抗体的载体中,通过pcr法使用含有限制酶序列的引物扩增实施例19中获得的基因。作为h链的引物,使用核苷酸序列(5'gcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgaagcagtcag 3')和(5'agacggtgaccgtggtgccttggcccc3'),而作为l链的引物,使用核苷酸序列(5'tcgagctcactcagtctccactctccctgcct3')和(5'cacctgcggccgcccgtttcagctc3')的序列。pcr条件是使用geneamp pcr试剂盒和amplitaq dna聚合酶(takara shuzo),每个循环为94℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟,重复30个循环。所用的pcr设备型号是dna热循环仪480(perkin elmer)。用限制酶sfii(toyobo)和bstpi(takara shuzo)消化扩增基因的h链,用限制酶saci(takara shuzo)和noti(takara shuzo)消化扩增基因的l链,然后在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。切割和提取含有相应dna片段的凝胶部分。从电泳琼脂糖凝胶提取dna片段使用gene cleanii试剂盒(funakoshi)。
至于产生scfv抗体的载体,在抗cd34抗体基因可导入之前首先制备产生任何期望抗体基因的质粒。使用重组噬菌体抗体系统试剂盒(pharmacia),可插入任何期望的产生抗体的杂交瘤基因。制备载体的方法按试剂盒附带手册进行。
用限制酶saci(takara shuzo)和noti(takara shuzo)消化含有任何目标抗体基因的质粒,然后将消化产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳,提取和纯化缺失了l链区域的载体dna片段。将该dna片段与前面制备的抗cd34抗体的l链基因连接以插入l链基因。然后,用限制酶sfii(toyobo)和bstpi(takara shuzo)消化取代了l链的质粒,之后将消化产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳,提取和纯化缺失了h链区域的载体dna片段。将该dna片段与前面制备的抗cd34抗体的h链基因连接以插入h链基因。对于上述连接,采用连接试剂盒第2版(takara shuzo)。从电泳琼脂糖凝胶提取dna片段使用gene cleanii试剂盒(funakoshi)进行。将上述方法获得的质粒导入大肠杆菌hb2151(pharmacia)中。转化的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的添加了2%葡萄糖的2×yt平板上,培养过夜。从出现的菌落选择若干菌落,用传统方法提取和纯化质粒dna。用适当限制酶检查质粒的消化模式,选择消化模式与期望模式相同的那些质粒。通过上述操作获得的表达具有抗cd4抗体序列的scfv抗体的质粒命名为pcanmy10。
将转化了上述质粒的大肠杆菌细胞在添加了100ug/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的sb培养基(3.5%细菌用胰蛋白胨,2%细菌用酵母提取物,0.5%nacl)中培养。第二天,取一部分加至10倍量的上述培养基中。培养1小时后,丢弃上清液,培养基用等量添加了1mm iptg、100ug/ml氨苄青霉素的sb培养基更换。再培养3小时,然后按照rpas纯化模块(rpas purification module,pharmacia)的手册处理细胞以回收周质中的抗体。获得的粗抗体部分用etag抗体柱(pharmacia)纯化。使用该柱纯化采用附带试剂根据附带手册进行。通过上述操作,获得了scfv抗体的纯化制品。[实施例22]使用实施例21中获得的抗cd34 scfv抗体的纯化制品,检测人cd34抗原。用1ml含0.05%triton x100(nakarai tesc)的pbs(-)在冰上处理1×107kg-1a细胞10分钟,以从细胞膜提取蛋白质。所用kg-1a细胞是在含10%胎牛血清的rpmi-1640培养基中培养的。在巯基乙醇存在下将提取溶液(10ul)煮沸3分钟。该溶液用sds聚丙烯酰胺电泳凝胶(aci)展开。电泳在凝胶附带手册所述的条件下进行。电泳后,将凝胶中的蛋白质转移至pvdf(biorad)膜上。转移使用25mm tris、192mm甘氨酸缓冲液和电泳电源eps 600装置(pharmacia)在100v进行,时间为1小时。在室温用添加了10%脱脂奶的pbs(-)封闭滤膜1小时。将滤膜用0.05%tween-20洗涤,然后与15ug/ml单链抗体反应1小时。
接着洗涤滤膜,并与作为二抗的5ug/ml抗e标签抗体(phannacia)反应。进一步洗涤滤膜并与5ug/ml过氧化物酶标记的作为三抗的抗鼠fc抗体反应1小时。洗膜后,用ecl溶液(amersham)处理结合了第一抗体的电泳条带使其发光,用高敏感感光胶片(hyperfilin-eclamersham)检测。结果,象阳性对照一样,检测到cd34分子条带在约120kd处。作为阳性对照,通过使用抗hpca-1抗体(becton dickinson)作为第一抗体、过氧化物酶标记的抗鼠fc抗体作为二抗制备滤膜,并以相同方式显色。作为阴性对照,仅除去一抗单链抗体并以相同方式处理。没有检测到120kd的条带。因此,证明抗cd34单链抗体可检测cd34分子。[实施例23]收集脐带血(29ml),用hanks平衡生理盐水(gibco)制成48ml。向4个已各加入3ml ficoll-paque(phamacia)的离心管分加12ml等分试样,在800rpm、20分钟条件下进行分离,回收单核细胞层的细胞。将回收的细胞用hanks液洗涤。向2.0×107该细胞中加入5ug实施例20中产生的人-鼠嵌合抗体至1ul/ml,于冰上反应30分钟。用hanks液洗涤细胞后,加入9×106dyna珠(dynal)抗人ig珠,将混合物在冰上反应1小时。按照附带手册操作dyna珠的分离。获得的细胞在添加了10%胎牛血清的dmem培养基中于5%二氧化碳气体下37℃培养14小时。培养后,通过吹打完全分离细胞和珠。按照附带手册用磁铁除去dyna珠。取一部分回收的细胞用于测定细胞数以获得回收细胞的数量。剩余的细胞与抗hpca-2抗体(becton)在冰上反应30分钟,用含2%胎牛血清的冷生理盐水洗涤,离心回收。用流式细胞仪(coulter)测定所获得细胞的cd34阳性细胞比例。cd34阳性比例假定是cd34细胞的纯度,cd34阳性比例乘以回收的细胞数得到的细胞数假定为回收的cd34阳性细胞数。cd34阳性细胞回收比例从分离前的阳性细胞数和回收的阳性细胞数来计算。结果,cd34阳性细胞纯度为80.4%,回收率为45.3%。这揭示实施例20中产生的人-鼠嵌合抗体分离了cd34阳性细胞。[实施例24]用cnbr活化的sepharose4b(pharmacia)制备实施例20中产生的人-鼠嵌合抗体结合的抗体柱。采用附带手册的方法将抗体与sepharose4b珠结合。使人-鼠嵌合抗体溶液与4.0ml凝胶反应制备结合效率为99.5%的亲和凝胶。硅化处理在柱中底部固定了少量玻璃丝的玻璃柱(2cm2×3cm),在柱中填充1ml前面制备的凝胶制成分离细胞的凝胶柱。
向32ml脐带血液中加入3ml硅溶胶(immune biology researchinstitute co.,ltd.),并将混合物于37℃孵育1小时。用hanks平衡生理盐水(gibco)配制细胞悬液至48ml,分别向每个已加入了3ml ficoll-paque(pharmacia)的4个离心管中加入12ml等分试样,在800 rpm离心20分钟条件下进行分离,回收单核细胞层的细胞。将回收的细胞用hanks液洗涤。取1ml含有2.1×107这种细胞的细胞悬液加入上述抗体柱中,于4℃轻微搅拌反应1小时。向该柱通入含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的hanks平衡生理盐水洗涤细胞。加入2ml含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的mem培养基(gibco),然后将柱子在二氧化碳孵育箱中37℃培养13小时。上下晃动不太强烈地搅动凝胶,从柱子回收培养基。进一步向该柱流过5ml含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的hanks平衡生理盐水,并回收该溶液。通过离心回收这些回收溶液中的细胞。对一部分细胞计数。剩下的细胞与抗hpca-2抗体(becton)在冰上反应30分钟,用含2%胎牛血清的冷生理盐水洗涤,并离心回收。用流式细胞仪(coulter)测定获得细胞的cd34阳性细胞比例。假定cd34阳性比例是cd34细胞的纯度,cd34阳性比例乘以回收的细胞数得到的细胞数为回收的cd34阳性细胞数。结果,获得的纯度为45.2%,回收率为62.6%。这揭示含有填充了凝胶的柱子装置用于分离未分化造血细胞的设备是有效的。[实施例25]
收集脐带血(29ml),用hanks平衡生理盐水(gibco)制成48ml。向4个已各加入3ml ficoll-paque(phamacia)的离心管分加12ml等分试样,在800rpm离心20分钟条件下进行分离,回收单核细胞层的细胞。将回收的细胞用hanks液洗涤。向2.0×107该细胞中加入25ug实施例21中产生的单链抗体抗体至5ul/ml,于冰上反应1小时。用hanks液洗涤细胞后,将细胞与抗etag(pharmacia)抗体反应30分钟。细胞洗涤后,加入9×106dyna珠(dynal)抗鼠igg珠,将混合物在冰上反应1小时。按照dyna珠附带手册,将dyna珠和吸附其上的细胞一起分离。获得的细胞在添加了10%胎牛血清的dmem培养基中于5%二氧化碳气体下37℃培养12小时。培养后,通过吹打完全分离细胞和珠。按照附带手册用磁铁除去dyna珠。取一部分回收的细胞用于测定细胞数以获得回收细胞的数量。剩余的细胞与抗hpca-2抗体(becton)在冰上反应30分钟,用含2%胎牛血清的冷生理盐水洗涤,离心回收。用流式细胞仪(coulter)测定所获得细胞的cd34阳性细胞比例。cd34阳性比例假定是cd34细胞的纯度,cd34阳性比例乘以回收的细胞数得到的细胞数假定为回收的cd34阳性细胞数。结果,获得的纯度为36.1%,回收率为35.3%。这揭示实施例21中产生的人-鼠嵌合抗体分离了cd34阳性细胞。[实施例26]用cnbr活化的sepharose4b(pharmacia)制备实施例21中产生的单链抗体结合的抗体柱。采用附带手册的方法将抗体与sepharose4b珠结合。使单链抗体溶液与4.0ml凝胶反应制备结合效率为99.0%的亲和凝胶。将柱中底部固定了少量玻璃丝的玻璃柱(2cm2×4cm)硅化处理,在柱中填充1ml前面制备的凝胶制成分离细胞的凝胶柱。
向28ml脐带血液中加入3ml硅溶胶(immune biology researchinstitute co.,ltd.),并将混合物于37℃孵育1小时。用hanks平衡生理盐水(gibco)配制细胞悬液至48ml,分别向每个离心管已加入了3mlficoll-paque(pharmacia)的4个离心管中加入12ml等分试样,在800rpm离心20分钟条件下进行分离,回收单核细胞层的细胞。将回收的细胞用hanks液洗涤。取1ml含有1.8×107这种细胞的细胞悬液加入上述抗体柱中,于4℃轻微搅拌反应1小时。向该柱通入含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的hanks平衡生理盐水洗涤细胞。加入2ml含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的mem培养基(gibco),然后将柱子在二氧化碳孵育箱中37℃培养13小时。上下晃动不太强烈地搅拌凝胶,从柱子回收培养基。进一步向该柱流过5ml含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的hanks平衡生理盐水,并回收该溶液。通过离心回收这些回收溶液中的细胞。对一部分细胞计数。剩下的细胞与抗hpca-2抗体(becton)在冰上反应30分钟,用含2%胎牛血清的冷生理盐水洗涤,并离心回收。用流式细胞仪(coulter)测定获得细胞的cd34阳性细胞比例。cd34阳性比例假定是cd34细胞的纯度,cd34阳性比例乘以回收的细胞数得到的细胞数假定为回收的cd34阳性细胞数。结果,获得的纯度为52.8%,回收率为41.0%。这揭示含有填充了凝胶的柱子装置用于分离未分化造血细胞的设备是有效的。[实施例27]改善实施例21中制备的载体pcanmy10,以制备能增加与水不溶性载体结合能力的抗体。在单链抗体羧基端的e标签序列之后导入3个赖氨酸残基。利用pcanmy10载体的限制酶位点,通过pcr法导入含有赖氨酸残基的序列。序列显示在序列表的序列号4中。
将该载体导入大肠杆菌hb2151株细胞中,并按实施例21中相同的方式制备单链抗体。
用cnbr活化的sepharose4b(pharmacia)制备所获单链抗体结合的抗体柱。采用附带手册的方法将抗体与sepharose4b珠结合。使单链抗体溶液与4.0ml凝胶反应制备亲和凝胶。硅化处理在柱中底部固定了少量玻璃丝的玻璃柱(2cm2×3cm),在柱中填充1ml前面制备的凝胶,制成分离细胞的凝胶柱装置。
向32ml脐带血液中加入3ml硅溶胶(immune biology researchinstitute co.,ltd.),并将混合物于37℃孵育1小时。用hanks平衡生理盐水(gibco)配制细胞悬液至48ml,分别向每个离心管已加入了3mlficoll-paque(pharmacia)的4个离心管中加入12ml等分试样,在800rpm离心20分钟条件下进行分离,回收单核细胞层的细胞。将回收的细胞用hanks液洗涤。取1ml含有2.1×107这种细胞的细胞悬液加入上述抗体柱中,于4℃轻微搅拌反应1小时。向该柱通入含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的hanks平衡生理盐水洗涤细胞。加入2ml含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的mem培养基(gibco),然后将柱子在二氧化碳孵育箱中37℃培养14小时。上下晃动不太强烈地搅动凝胶,从柱子回收培养基。进一步向该柱流过5ml含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的hanks平衡生理盐水,并回收该溶液。通过离心回收这些回收溶液中的细胞。对一部分细胞计数。剩下的细胞与抗hpca-2抗体(becton)在冰上反应30分钟,用含2%胎牛血清的冷生理盐水洗涤,并离心回收。用流式细胞仪(coulter)测定所获得细胞的cd34阳性细胞比例。cd34阳性比例假定是cd34细胞的纯度,cd34阳性比例乘以回收细胞数得到的细胞数假定为回收的cd34阳性细胞数。结果,获得的纯度为71.0%,回收率为52.0%。这证实含有填充了凝胶的柱子装置用于分离未分化造血细胞的设备是有效的,而且表明羧基端导入了赖氨酸的重组抗体能更有效地分离细胞。
工业实用性根据本发明,cd4阳性细胞和cd34细胞的分离可特异和有效地进行。本发明在以治疗自身免疫疾病为目的的具有自身反应性抗原受体的t淋巴细胞的收集、从用于骨髓移植的细胞中清除淋巴细胞等领域是有效的。本发明在以治疗白血病为目的的收集未分化造血细胞、从用于骨髓移植的细胞清除淋巴细胞等领域也是有效的。
微生物保藏信息a.保藏微生物的保藏机构的名称和地址保藏机构
日本国际贸易和工业部工业科学技术局生物科学和人类技术国家研究所(national institute of bioscience and human-technology,agencyof industrial science and technology,ministry of international tradeand industry,japan)地址1-3,higashi i-chome,tsukuba-shi,lbaraki-ken,japanb.保藏至保藏机构的日期1998年5月14日c.保藏机构指定的保藏号ferm bp-6729请注意,基于1998年5月14日的原始保藏(保藏号ferm p-16807),该保藏已于1999年5月21日转移为布达佩斯条约下的保藏。
序列表<110> asahikasei kogyo kabushiki kaishaasahi medical co.,ltd.<120> 细胞分离装置和分离方法<130> asahi-1<150> jp 10/159957jp 10/163023<151> 1998-5-251998-5-26<160> 48<210> 1<211> 5<212> prt<213> 小鼠<400> 1asp tyr val ile asn1 5<210> 2<211> 17<212> prt<213> 小鼠<400> 2glu ile tyr pro gly ser gly ser ala tyr tyr asn glu met phe lys1 5 10 15gly<210> 3<211> 9<212> prt<213> 小鼠<400> 3arg gly thr gly thr gly phe ala tyr1 5<210> 4<211> 15<212> prt<213> 小鼠<400> 4lys ala ser gln ser val asp tyr asp gly asp ser tyr met asn1 5 10 15<210> 5<211> 7<212> prt<213> 小鼠<400> 5ala ala ser asn leu glu ser1 5<210> 6<211> 9<212> prt<213> 小鼠<400> 6gln gln ser ser glu asp pro pro thr1 5<210> 7<211> 330<212> dna<213> 小鼠<400> 7cct gag ctg gtg aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct48pro glu leu val lys pro gly ala ser val lys met ser cys lys ala1 5 10 15tct gga tac aca ttc act gac tat gtt ata aac tgg ttg aac cag aga96ser gly tyr thr phe thr asp tyr val ile asn trp leu asn gln arg20 25 30act gga cag ggc ctt gag tgg 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27<210> 20<211> 27<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 20tgggcccgtc gttttggctg cagagac 27<210> 21<211> 56<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 21tcatgaaata cctgctgccg accgctgctg ctggtctgct gctcctcgcg gcccag 56<210> 22<211> 56<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 22tgcggccgca gccatggtgt ttgcggccat cgccggctgg gccgcgagga gcagca 56<210> 23<211> 56<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 23tgcggccgca gactacaagg atgacgatga caaaggctcg agcgagcaga agctga 56<210> 24<211> 57<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 24ggtgggtcga cctcgagccc agatcctctt cgctgatcag cttctgctcg ctcgagc 57<210> 25<211> 23<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 25tgcggccgca gactacaagg atg 23<210> 26<211> 56<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 26taagcttatc atttggtcga cccgtggtga tgatgatggt gggtcgacct cgagcc 56<210> 27<211> 38<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 27agccggccat ggccgacatt gtgctgaccc aatctcca 38<210> 28<211> 58<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 28ctccggagcc acctccgcct gaaccgcctc cacctttgat ttccagcttg gtgcctcc58<210> 29<211> 40<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 29ctccggaggt ggcggatcgc aggttcagct gcagcagtct40<210> 30<211> 31<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 30tgcggccgct gcagagacag tgaccagagt c 31<210> 31<211> 35<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 31agccggccat ggcccaggtt cagctgcagc agtct 35<210> 32<211> 56<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 32ctccggagcc acctccgcct gaaccgcctc cacctgcaga gacagtgacc agagtc 56<210> 33<211> 43<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 33ctccggaggt ggcggatcgg acattgtgct gacccaatct cca43<210> 34<211> 33<212> dna<213> 合成序列<220><223> 用于pcr的单链dna引物<400> 34tgcggccgct ttgatttcca gcttggtgcc tcc 33<210> 35<211> 118<212> prt<213> 小鼠<400> 35gln val gln leu gln gln ser gly pro glu leu val lys pro gly ala1 5 10 15ser val lys met ser cys lys ala ser gly tyr thr phe thr asp tyr20 25 30val ile asn trp leu asn gln arg thr 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权利要求
1.使用选自嵌合抗体、单链抗体或其组合的抗体分离细胞的装置。
2.使用选自可结合cd4分子的嵌合抗体、单链抗体或其组合的抗体分离cd4阳性细胞的装置。
3.使用嵌合抗体分离cd4阳性细胞的装置,其中抗体包含如下h链可变区、l链可变区和人fc区,所述h链可变区的cdr-1是序列表中的序列号1的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号2的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号3的氨基酸序列,而所述l链可变区的cdr-1是序列表中的序列号4的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号5的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号6的氨基酸序列。
4.使用单链抗体分离cd4阳性细胞的装置,其中该抗体包含如下h链可变区和l链可变区,所述h链可变区的cdr-1是序列表中的序列号1的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号2的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号3的氨基酸序列,而所述l链可变区的cdr-1是序列表中的序列号4的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号5的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号6的氨基酸序列。
5.使用选自可与cd34分子结合的嵌合抗体、单链抗体或其组合的抗体分离cd34阳性细胞的装置。
6.使用抗体分离人cd34阳性细胞的装置,其中该抗体包含如下h链可变区、l链可变区和人fc区,所述h链可变区的cdr-1是序列表中的序列号43的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号44的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号45的氨基酸序列,而所述l链可变区的cdr-1是序列表中的序列号46的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号47的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号48的氨基酸序列。
7.使用单链抗体分离人cd34阳性细胞的装置,其中该抗体包含如下h链可变区和l链可变区,所述h链可变区的cdr-1是序列表中的序列号43的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号44的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号45的氨基酸序列,而所述l链可变区的cdr-1是序列表中的序列号46的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号47的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号48的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7之任一项分离细胞的装置,其中抗体包含在抗体氨基酸序列的c端或n端或两端加入了碱性氨基酸或酸性氨基酸的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8之任一项分离细胞的装置,其中选自嵌合抗体、单链抗体或其组合的抗体结合与卤代乙酰氨基甲基化试剂反应的聚丙烯无纺织物的活性基团。
10.分离或检测细胞的方法,其包括使用选自嵌合抗体、单链抗体或其组合的抗体。
11.分离或检测cd4阳性细胞的方法,其包括使用选自可结合cd4分子的嵌合抗体、单链抗体或其组合的抗体。
12.分离或检测cd4阳性细胞的方法,其包括使用嵌合抗体,其中抗体包含如下h链可变区、l链可变区和人fc区,所述h链可变区的cdr-1是序列表中的序列号1的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号2的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号3的氨基酸序列,而所述l链可变区的cdr-1是序列表中的序列号4的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号5的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号6的氨基酸序列。
13.分离或检测cd4阳性细胞的方法,其包括使用单链抗体,其中该抗体包含如下h链可变区和l链可变区,所述h链可变区的cdr-1是序列表中的序列号1的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号2的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号3的氨基酸序列,而所述l链可变区的cdr-1是序列表中的序列号4的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号5的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号6的氨基酸序列。
14.分离或检测cd34阳性细胞的方法,其包括使用选自可与cd34分子结合的嵌合抗体、单链抗体或其组合的抗体。
15.分离或检测人cd34阳性细胞的方法,其包括使用抗体,其中该抗体包含如下h链可变区、l链可变区和人fc区,所述h链可变区的cdr-1是序列表中的序列号43的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号44的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号45的氨基酸序列,而所述l链可变区的cdr-1是序列表中的序列号46的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号47的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号48的氨基酸序列。
16.分离或检测人cd34阳性细胞的方法,其包括使用单链抗体,其中该抗体包含如下h链可变区和l链可变区,所述h链可变区的cdr-1是序列表中的序列号43的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号44的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号45的氨基酸序列,而所述l链可变区的cdr-1是序列表中的序列号46的氨基酸序列,cdr-2是序列表中的序列号47的氨基酸序列,cdr-3是序列表中的序列号48的氨基酸序列。
17.根据权利要求10-16之任一项分离或检测细胞的方法,其中抗体包含在抗体氨基酸序列的c端或n端或两端加入了碱性氨基酸或酸性氨基酸的氨基酸序列。
18.含有如下h链可变区并对cd4抗原具有亲和力的抗体,该h链可变区的cdr-1、cdr-2和cdr-3分别是序列表中的序列号1、2和3的氨基酸序列。
19.含有如下l链可变区并对cd4抗原具有亲和力的抗体,该l链可变区的cdr-1、cdr-2和cdr-3分别是序列表中的序列号4、5和6的氨基酸序列。
20.保藏号为ferm bp-6729的杂交瘤4h5产生的抗cd4抗原的单克隆抗体。
21.编码根据权利要求18-20之任一项的抗体的核酸。
22.根据权利要求21的核酸,其含有序列号7和8所述核苷酸序列。
23.使用根据权利要求21或22的核酸产生抗体的方法。
24.可按权利要求23的方法获得的对cd4抗原具有亲和力的重组抗体。
25.根据权利要求24的重组抗体,其中该抗体具有人的fc区。
26.根据权利要求24的重组抗体,其中该抗体是单链抗体。
27.含有根据权利要求18-20之任一项的抗体和药物学上可接受载体的医药组合物。
28.含有根据权利要求24-26之任一项的重组抗体和药物学上可接受载体的医药组合物。
全文摘要
分离人未分化造血细胞之cd(族分化)阳性细胞的装置和分离或检测这些细胞的方法。在上述装置和方法中,cd阳性细胞是使用通过分离抗cd4或抗cd34抗体基因并表达这些基因获得的识别cd分子的重组抗体来分离的。该装置和方法可有效应用于收集未分化造血细胞、从用于骨髓移植的细胞中除去淋巴细胞、检测白血病细胞等医学领域。也可使用上述抗体制备用于自身免疫病的医药组合物。
文档编号c07k16/28gk1307640sq99808058
公开日2001年8月8日 申请日期1999年5月24日 优先权日1998年5月25日
发明者大野满春, 草加孝之, 森本几夫, 宫村耕一 申请人:旭化成株式会社, 旭医学株式会社
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