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文档序号:36497289发布日期:2023-12-27 19:41阅读:0来源:国知局
用于检测靶向基因变异和病毒基因组的系统及其制备和使用方法


背景技术:

1.由于严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(mers-cov)和冠状病毒疾病
2019(covid19)相关冠状病毒(sars-cov-2)的大爆发,冠状病毒已成为近年来的重大公共卫生问题。
对病毒筛查系统的需求大量增加,以识别潜在的感染者,阻止病毒的传播。
目前冠状病毒检测的黄金标准仍然是实时pcr和逆转录酶pcr(rt-pcr)测定。
几种基于抗体的侧流测试也被使用,但是与基于pcr的测试相比,通常缺乏敏感性。
然而,基于pcr的测定需要使用实验室设备如pcr机器,这限制了这些测试的可扩展性。
2.老年人是冠状病毒感染风险最高的人群之一。
冠状病毒感染的老年人的疾病严重程度和死亡率高。
特别地,患有痴呆(例如阿尔茨海默病和帕金森病)的老年人,感染、传播感染和出现更严重疾病结果的风险更高。
但是,在大流行期间,建议老年人不要去医院和诊所接受痴呆测试。
有必要对有患痴呆风险的老年人进行筛查,在早期阶段保护他们免受冠状病毒感染。
3.此外,由病毒感染触发的氧化应激是导致器官损伤和呼吸窘迫的途径之一。
因此,应对氧化应激的系统较弱的人也可能容易受到冠状病毒感染。
4.有研究揭示了不同的单核苷酸核苷酸多态性(snp)如何影响痴呆的发展风险和具有较弱的抗氧化应激系统。
因此,筛查个体基因组中这类snp的存在可以有助于筛查和识别那些更容易受到冠状病毒感染的个体。
5.等温扩增技术是可以利用具有链置换活性的dna聚合酶在恒温下进行的核酸扩增反应。
通过将引物、底物、具有链置换活性的dna聚合酶和样品的反应混合物在恒温下温育
30-60min,可以在一个步骤中完成扩增。
环介导的等温扩增(lamp)是一种等温扩增技术,通过使用专门设计的
4-5种不同的引物识别靶基因区中的
6-8个不同区域,实现靶标特异性扩增。
这增加
lamp的特异性。lamp通常在单个反应中扩增目标拷贝
109-1010倍。
广泛的扩增会产生大量的质子,并且可以显著影响
lamp反应混合物的ph值。
因此,也有可能简单地通过使用ph指示剂来检测成功的
lamp反应,而不需要使用实验室设备来检测最终的dna产物。
6.总之,亟需开发用于筛查可能感染冠状病毒的个体以及用于筛查具有更高的痴呆风险和较弱的抗氧化应激系统的老年人的护理点方法。lamp技术可能是一种很有前途的方法,通过设计针对冠状病毒基因组以及与阿尔茨海默病、帕金森病风险增加和抗氧化基因活性降低相关的snp的特异性引物,用于国产试剂盒,以识别这类个体。
由于
lamp不需要pcr机器,并且其结果可以通过比色变化来检测,所以它可以由未经培训的个体进行并用于护理点的场景。


技术实现要素:

7.在一些实施方案中,核酸筛查试剂盒可以包含:正向内侧引物,其包含选自seq id no.3、8、13、18、23、28、33、37、42、47、52、57、62和
67的核酸序列;以及反向内侧引物,其包含
选自seq id no.4、9、14、19、24、29、34、38、43、48、53、58、63和
68的核酸序列。
8.在一些实施方案中,核酸筛查试剂盒可以进一步包含:正向外侧引物,其包含选自seq id no.1、6、11、16、21、26、31、35、40、45、50、55、60

65的核酸序列;以及反向外侧引物,其包含选自seq id no.2、7、12、17、22、27、32、36、41、46、51、56、61和
66的核酸序列。
9.在一些实施方案中,核酸筛查试剂盒可以进一步包含
loop-f引物,其包含选自seq id no.5、10、15、20、25、30、39、44、49、54、59、64和
69的核酸序列。
10.在一些实施方案中,核酸筛查试剂盒可以进一步包含逆转录酶。
在一些实施方案中,核酸筛查试剂盒可以进一步包含ph指示剂。
11.在一些实施方案中,核酸筛查试剂盒可以进一步包含以下的一种或多种:阳性对照样品;阴性对照样品;具有链置换活性的dna聚合酶;dntp;和反应缓冲液。
12.在一些实施方案中,正向内侧引物包含seq id no.3的核酸序列;反向内侧引物包含seq id no.4的核酸序列;正向外侧引物包含seq id no.1的核酸序列;反向外侧引物包含seq id no.2的核酸序列。
13.在一些实施方案中,核酸筛查试剂盒可以进一步包含
loop-f引物,其包含seq id no.5的核酸序列。
14.在一些实施方案中,检测受试者体内靶核苷酸序列的方法可以包含:制备反应混合物,其包含来自受试者的生物样品;正向内侧引物,其包含选自seq id no.3、8、13、18、23、28、33、37、42、47、52、57、62和
67的核酸序列;反向内侧引物,其包含选自seq id no.4、9、14、19、24、29、34、38、43、48、53、58、63和
68的核酸序列;具有链置换活性的dna聚合酶;dntp;ph指示剂;以及反应缓冲液;温育反应混合物以产生温育的混合物;以及测量温育的混合物的浊度、荧光和比色变化中的一种或多种以确定结果,其中:浊度、荧光和比色变化中的一种或多种表示阳性结果,而阳性结果表示靶核苷酸序列的存在。
15.在一些实施方案中,用于检测受试者体内靶核苷酸序列的方法的反应混合物可以进一步包含:正向外侧引物,其包含选自seq id no.1、6、11、16、21、26、31、35、40、45、50、55、60

65的核酸序列;以及反向外侧引物,其包含选自seq id no.2、7、12、17、22、27、32、36、41、46、51、56、61和
66的核酸序列。
16.在一些实施方案中,用于检测受试者体内靶核苷酸序列的方法的反应混合物可以进一步包含
loop-f引物,其包含选自seq id no.5、10、15、20、25、30、39、44、49、54、59、64和
69的核酸序列。
17.在一些实施方案中,用于检测受试者体内靶核苷酸序列的方法的反应混合物可以包含:包含seq id no.3的核酸序列的正向内侧引物;包含seq id no.4的核酸序列的反向内侧引物;包含seq id no.1的核酸序列的正向外侧引物;包含seq id no.2的核酸序列的反向外侧引物;和包含seq id no.5的核酸序列的
loop-f引物。
18.在一些实施方案中,检测受试者体内靶核苷酸序列的存在的核酸筛查试剂盒可以包含第一反应管,其包含:正向内侧引物,其包含选自seq id no.3、8、13、18、23、28、33、37、42、47、52、57、62和
67的核酸序列;反向内侧引物,其包含选自seq id no.4、9、14、19、24、29、34、38、43、48、53、58、63和
68的核酸序列,具有链置换活性的dna聚合酶;dntp;以及ph指示剂;阳性对照管,其包含:正向内侧引物,包含选自seq id no.3、8、13、18、23、28、33、37、42、47、52、57、62和
67的核酸序列;反向内侧引物,其包含选自seq id no.4、9、14、19、24、29、34、38、43、48、53、58、63和
68的核酸序列;具有链置换活性的dna聚合酶;dntp;ph指示剂;以及与靶核苷酸序列基本上相同的合成核苷酸序列;以及阴性对照管,其包含:正向内侧引物,其包含选自seq id no.3、8、13、18、23、28、33、37、42、47、52、57、62和
67的核酸序列;反向内侧引物,其包含选自seq id no.4、9、14、19、24、29、34、38、43、48、53、58、63和
68的核酸序列;具有链置换活性的dna聚合酶;dntp;以及ph指示剂。
19.在一些实施方案中,第一反应管、阳性对照管和阴性对照管中的每一个可以进一步包含
loop-f引物,其包含选自seq id no.5、10、15、20、25、30、39、44、49、54、59、64和
69的核酸序列。
20.在一些实施方案中,核酸筛查试剂盒可以进一步包含:第二反应管,其包含:正向内侧引物,其包含选自seq id no.3、8、13、18、23、28、33、37、42、47、52、57、62和
67的核酸序列;反向内侧引物,其包含选自seq id no.4、9、14、19、24、29、34、38、43、48、53、58、63和
68的核酸序列;具有链置换活性的dna聚合酶;dntp;以及ph指示剂。
21.在一些实施方案中,检测受试者体内靶核苷酸序列的存在的核酸筛查试剂盒可以包含:第一反应管,其包含:正向内侧引物,其包含选自seq id no.3、8、13、18、23、28、33、37、42、47、52、57、62和
67的核酸序列;反向内侧引物,其包含选自seq id no.4、9、14、19、24、29、34、38、43、48、53、58、63和
68的核酸序列;正向外侧引物,其包含选自seq id no.1、6、11、16、21、26、31、35、40、45、50、55、60

65的核酸序列;以及反向外侧引物,其包含选自seq id no.2、7、12、17、22、27、32、36、41、46、51、56、61和
66的核酸序列;具有链置换活性的dna聚合酶;dntp;以及ph指示剂;阳性对照管,其包含:正向内侧引物,其包含选自seq id no.3、8、13、18、23、28、33、37、42、47、52、57、62和
67的核酸序列;反向内侧引物,其包含选自seq id no.4、9、14、19、24、29、34、38、43、48、53、58、63和
68的核酸序列;正向外侧引物,其包含选自seq id no.1、6、11、16、21、26、31、35、40、45、50、55、60

65的核酸序列;反向外侧引物,其包含选自seq id no.2、7、12、17、22、27、32、36、41、46、51、56、61和
66的核酸序列;具有链置换活性的dna聚合酶;dntp;ph指示剂;以及与靶核苷酸序列基本上相同的合成核苷酸序列;以及阴性对照管,其包含:正向内侧引物,其包含选自seq id no.3、8、13、18、23、28、33、37、42、47、52、57、62和
67的核酸序列;反向内侧引物,其包含选自seq id no.4、9、14、19、24、29、34、38、43、48、53、58、63和
68的核酸序列;正向外侧引物,其包含选自seq id no.1、6、11、16、21、26、31、35、40、45、50、55、60

65的核酸序列;反向外侧引物,其包含选自seq id no.2、7、12、17、22、27、32、36、41、46、51、56、61和
66的核酸序列;具有链置换活性的dna聚合酶;dntp;以及ph指示剂。
22.在一些实施方案中,核酸筛查试剂盒可以进一步包含:第二反应管,其包含:正向内侧引物,其包含选自seq id no.3、8、13、18、23、28、33、37、42、47、52、57、62和
67的核酸序列;反向内侧引物,其包含选自seq id no.4、9、14、19、24、29、34、38、43、48、53、58、63和
68的核酸序列;正向外侧引物,其包含选自seq id no.1、6、11、16、21、26、31、35、40、45、50、55、60

65的核酸序列;以及反向外侧引物,其包含选自seq id no.2、7、12、17、22、27、32、36、41、46、51、56、61和
66的核酸序列;具有链置换活性的dna聚合酶;dntp;以及ph指示剂。
具体实施方式
23.本公开涉及
lamp引物组,其可以用于核酸筛查以检测特定核苷酸序列。
具体地,本
公开的
lamp引物可以用于核酸筛查试剂盒以及从生物样品中检测一个或多个靶核苷酸序列的方法。
本公开的
lamp引物可以用于(i)筛查核酸样品中与较弱的抗氧化代谢和较高的神经系统疾病风险相关的snp,以及根据一些实施方案,(ii)检测来自冠状病毒的病毒基因组。
本公开进一步涉及使用
lamp引物组的方法。
一种方法可以包括提供反应混合物,每个反应混合物可以包含至少一个
lamp测定引物组,该引物组对(i)与较弱的抗氧化代谢相关的snp;(ii)与较高的神经系统疾病风险相关的snp;和/或(iii)来自病毒如冠状病毒的病毒基因具有特异性。
可以将待分析的样品与反应混合物混合,在适合产生
lamp测定反应产物的条件下温育,并且使用视觉方法检测反应产物。
24.根据一些实施方案,反应混合物可以包含以下一个或多个:至少一个
lamp测定引物组;镁离子;dntp;反应缓冲液;dna聚合酶;ph指示剂;以及来自受试者的唾液样品或鼻拭子样品。
25.在一些实施方案中,反应混合物中可以包含逆转录酶,以便从样品中的病毒rna基因组合成互补dna(cdna)用于检测。
26.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 65的靶向冠状病毒orf1ab基因的f3引物、seq id no 66的b3引物、seq id no 67的fip引物和seq id no 68的bip引物中的一个或多个。
引物组可以包含seq id no 69的
loopf引物。
27.待分析所列snp的存在和冠状病毒核酸的存在的样品可以获得自受试者。
在一些实施方案中,可以根据本公开的方法测定唾液样品或鼻拭子样品。
28.本公开包括提供反应混合物,其可以包含:对特定基因变异或病毒(例如,冠状病毒)基因组有特异性的
lamp引物组、镁离子、dntp、反应缓冲液、dna聚合酶和待分析的样品;将反应混合物在dna聚合酶反应条件下温育;反应产物的特异性扩增;以及通过ph指示剂的视觉颜色变化检测由于产物扩增成功而导致的反应混合物的ph变化。
任选地,反应混合物中可以包含逆转录酶以进行rt-lamp测定。
本文提供使用
lamp测定检测基因变异和/或病毒基因组的存在的方法,以及用于检测基因变异和/或病毒基因组的存在的
lamp测定试剂盒的组合物。
本公开的方法和材料为快速筛查具有遗传变异和/或可能易受病毒感染和/或目前感染冠状病毒的个体提供了一种简单、经济和护理点的实时pcr/rt-pcr替代方法。
本公开的方法和材料允许在国内进行筛查,这可以识别处于潜在风险的个体,他们可能需要进一步的医疗检查。
29.lamp可以是一步扩增反应,在等温条件下以高灵敏度和特异性扩增靶dna序列。lamp具有与传统实时pcr/rt-pcr相似的灵敏度和更高的效力。lamp反应混合物包含具有链置换活性的dna聚合酶和靶向靶基因内6个特定区域的4个引物,确保扩增反应的特异性。
可以在fip和bip引物的5’
端引入两个核苷酸错配,以检测靶基因的特异性snp。
在一些实施方案中,为了加速
lamp反应,可以添加额外的
loopf引物。
在一些实施方案中,为了检测rna病毒的存在,可以将热稳定的逆转录酶添加至
lamp反应混合物中,以进行逆转录环介导的等温扩增(rt-lamp)。
30.由于
lamp的效力可能很高,根据一些实施方案,鉴定成功的
lamp扩增可能不需要检测扩增产物。lamp扩增的核苷酸掺入步骤产生的大量质子可以显著降低
lamp反应混合物的ph值。
因此,通过向
lamp反应混合物添加ph指示剂,
lamp反应混合物的视觉颜色变化可以用来确定特异性
lamp扩增是否可能成功。
31.本公开提供一种简单和快速的筛查系统,用于检测来自个体的唾液样品和/或鼻拭子样品中存在的靶向基因变异和/或冠状病毒基因组,不需要进行核酸分离。lamp反应混合物的视觉颜色变化可能是靶向基因变异和冠状病毒基因组存在的阳性指标。
32.引物
33.本文提供针对靶向基因变体的引物,其使用标准
lamp和/或加速
lamp成功扩增靶向基因变体。
34.如上所述,
lamp反应混合物可以包含多个引物。
在一些实施方案中,
lamp混合物可以包含偶数个引物(例如,2个引物、4个引物、6个引物、8个引物等)。
在一些实施方案中,
lamp混合物可以包含4个引物,可以命名为正向内侧引物(fip)、反向内侧引物(bip)、正向外侧引物(f3)和反向外侧引物(b3)。
在一些实施方案中,可以将额外的引物
loop f添加至
lamp反应混合物中,以加快反应速度。
35.本公开提供的用于
lamp的引物包含可以与靶基因变体/冠状病毒基因组或靶基因变体/冠状病毒基因组的补体特异性杂交的核酸序列。
对于每个fip和bip,连接两个这样的核酸序列。
在一些实施方案中,可以在连接处添加接头,并且接头不与靶基因变体/冠状病毒基因组或靶基因变体/冠状病毒基因组的补体杂交。
接头可以是为连接区域提供柔性的核酸或非核酸部分。
根据一些实施方案,核酸接头包含
2-6个核苷酸或核苷酸类似物。
非核酸部分可以是肽、碳水化合物、脂质、聚醚、聚酰胺、聚酰胺和碳氢化合物。
36.在一些实施方案中,与参考人类基因组相比,可以在fip和bip的5’
端引入两个核苷酸错配。
这允许靶snp的特异性扩增。
第一个5’
核苷酸可以与靶snp匹配,但不与参考基因组匹配。
第二个5’
核苷酸可以与靶snp或参考基因组不匹配,以增加
lamp反应的特异性。
例如,如果靶snp具有序列“5’‑cg…‑3’”,参考基因组具有序列“5’‑gg…‑3’”(snp位点可以下划线),相应的fip/bip引物序列可以是“5’‑ca…‑
3”。
37.本公开提供引物,是与阿尔茨海默病风险相关的snp特异性的,靶向rs429358(apoe)、rs7412(apoe)、rs4343(ace)和rs6265(bdnf)。
38.本公开提供引物,是与帕金森病风险相关的snp特异性的,靶向rs7349186(pink1)、rs226249(dj1)、rs2736990(snca)和rs34637584(lrrk2)。
39.本公开提供引物,是与氧化应激风险相关的snp特异性的,靶向rs1871042(gstp)、rs1050450(gxt1)、rs4880(sod2)和rs1001179(cat)。
40.本公开提供引物,是冠状病毒基因组特异性的,靶向n基因和orf1ab。
41.本公开提供具有seq id no.“1-69”的引物序列。
在一些实施方案中,
lamp引物组可以选自:seq id no.1-69。
42.正向内侧引物可以包含选自seq id no.3、8、13、18、23、28、33、37、42、47、52、57、62和
67的核酸序列。
反向内侧引物可以包含选自seq id no.4、9、14、19、24、29、34、38、43、48、53、58、63和
68的核酸序列。
正向外侧引物可以包含选自seq id no.1、6、11、16、21、26、31、35、40、45、50、55、60

65的核酸序列。
反向外侧引物可以包含选自seq id no.2、7、12、17、22、27、32、36、41、46、51、56、61和
66的核酸序列。
43.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 1的靶向apoe(rs429358)中的snp的f3引物、seq id no 2的b3引物、seq id no 3的fip引物和seq id no 4的bip引物中的一个或多个。
引物组可以包含seq id no 5的
loopf引物。
44.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 6的靶向apoe(rs7412)中的snp的f3引物、seq id no 7的b3引物、seq id no 8的fip引物和seq id no 9的bip引物中的一个或多个。
引物组可以包含seq id no 10的
loopf引物。
45.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 11的靶向ace(rs4343)中的snp的f3引物、seq id no 12的b3引物、seq id no 13的fip引物和seq id no 14的bip引物中的一个或多个。
引物组可以包含seq id no 15的
loopf引物。
46.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 16的靶向bdnf(rs6265)中的snp的f3引物、seq id no 17的b3引物、seq id no 18的fip引物和seq id no 19的bip引物中的一个或多个。
引物组可以包含seq id no 20

loopf引物。
47.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 21的靶向pink1(rs7349186)中的snp的f3引物、seq id no 22的b3引物、seq id no 23的fip引物和seq id no 24的bip引物中的一个或多个。
引物组可以包含seq id no 25的
loopf引物。
48.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 26的靶向dj1(rs226249)中的snp的f3引物、seq id no 27的b3引物、seq id no 28的fip引物和seq id no 29的bip引物中的一个或多个。
引物组可以包含seq id no 30

loopf引物。
49.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 31的靶向snca(rs2736990)中的snp的f3引物、seq id no 32的b3引物、seq id no 33的fip引物和seq id no 34的bip引物中的一个或多个。
50.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 35的靶向
lrrk2(rs34637584)中的snp的f3引物、seq id no 36的b3引物、seq id no 37的fip引物和seq id no 38的bip引物中的一个或多个。
引物组可以包含seq id no 39的
loopf引物。
51.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 40
的靶向gstp1(rs1871042)中的snp的f3引物、seq id no 41的b3引物、seq id no 42的fip引物和seq id no 43的bip引物中的一个或多个。
引物组可以包含seq id no 44的
loopf引物。
52.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 45的靶向gxt1(rs1050450)中的snp的f3引物、seq id no 46的b3引物、seq id no 47的fip引物和seq id no 48的bip引物中的一个或多个。
引物组可以包含seq id no 49的
loopf引物。
53.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 50
的靶向sod2(rs4880)中的snp的f3引物、seq id no 51的b3引物、seq id no 52的fip引物和seq id no 53的bip引物中的一个或多个。
引物组可以包含seq id no 54的
loopf引物。
54.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 55的靶向cat(rs1001179)中的snp的f3引物、seq id no 56的b3引物、seq id no 57的fip引物和seq id no 58的bip引物中的一个或多个。
引物组可以包含seq id no 59的
loopf引物。
55.在一些实施方案中,
lamp引物组可以包含seq id no 60
的靶向冠状病毒n基因的f3引物、seq id no 61的b3引物、seq id no 62的fip引物和seq id no 63的bip引物中的一个或多个。
引物组可以包含seq id no 64的
loopf引物。
56.在本公开中,本文提供的所有与靶基因变体/冠状病毒基因组或靶基因变体/冠状病毒基因组的补体特异性杂交的引物可以包含至少
13个连续核苷酸,在一些实施方案中,至少
16个连续核苷酸,具有与靶基因变体/冠状病毒基因组或靶基因变体/冠状病毒基因组id no.40-44或基本上相同的核酸序列的核酸。
70.用于
lamp检测rs1050450(gxt1)的引物组可以包含具有seq id no.45-48或基本上相同的核酸序列的核酸。
用于加速
lamp检测rs1050450(gxt1)的引物组可以包含具有seq id no.45-49或基本上相同的核酸序列的核酸。
71.用于
lamp检测rs4880(sod2)的引物组可以包含具有seq id no.50-53或基本上相同的核酸序列的核酸。
用于加速
lamp检测rs4880(sod2)的引物组可以包含具有seq id no.50-54或基本上相同的核酸序列的核酸。
72.用于
lamp检测rs1001179(cat)的引物组可以包含具有seq id no.55-58或基本上相同的核酸序列的核酸。
用于加速
lamp检测rs1001179(cat)的引物组可以包含具有seq id no.55-59或基本上相同的核酸序列的核酸。
73.本公开提供冠状病毒基因组的特异性引物组,用于标准或加速
lamp反应。
在一些实施方案中,引物组检测n基因和orf1ab。
74.用于
lamp检测n基因的引物组可以包含具有seq id no.60-63或基本上相同的核酸序列的核酸。
用于加速
lamp检测n基因的引物组可以包含具有seq id no.60-64或基本上相同的核酸序列的核酸。
75.用于
lamp检测orf1ab的引物组可以包含具有seq id no.65-68或基本上相同的核酸序列的核酸。
用于加速
lamp检测orf1ab的引物组可以包含具有seq id no.65-69或基本上相同的核酸序列的核酸。
76.生物样品
77.本公开可以用于分析来自任何来源(例如,受试者)的生物样品是否存在靶基因变体/冠状病毒基因组。
生物样品可以是唾液样品或鼻拭子,但也可以是血液、血清、尿液和外周血单核细胞。
在一些实施方案中,样品可以是分离自生物样品的dna。
78.在本公开的一些实施方案中,可以将样品如唾液或鼻拭子与裂解液混合以释放dna。
在用于本公开提供的
lamp反应之前,可以不从样品纯化释放的dna。
裂解缓冲液的实例包含碱性裂解缓冲液、十二烷基硫酸钠(sds)裂解缓冲液和np-40
裂解缓冲液。
79.lamp反应
80.在本公开中,
lamp和加速
lamp可以包含一组或多组引物、dntp、缓冲液、镁离子、dna聚合酶、ph指示剂以及待分析靶snp/
冠状病毒基因组存在的生物样品。
在一些实施方案中,可以添加逆转录酶。
在一些实施方案中,可以添加反应增强添加剂。
81.反应混合物中包含的引物组可以是上述任何引物组或与上述任何引物组基本上相似的任何引物组,其中基本上相似表示具有与上述任何引物组至少
50
%相同,或至少
55%相同,或至少
60
%相同,或至少
65%相同,或至少
70
%相同,或至少
75%相同,或至少
80
%相同,或至少
85%相同,或至少
90
%相同,或至少
95%相同,或至少
98%相同,或至少
99%相同,或至少
100
%相同的核苷酸序列。
在一些实施方案中,反应混合物中可以包含一个以上的引物组。
82.可以添加镁离子,例如,镁盐如氯化镁或硫酸镁。
83.任何与试剂和反应相容的缓冲液都可以用来维持
lamp反应混合物在适合dna聚合酶工作的ph范围内。
这类缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液、tris-hcl/koh缓冲液和tricine缓冲液。
84.可以添加在反应混合物中的dna聚合酶是具有链置换活性的dna聚合酶。
在一些实施方案中,dna聚合酶可以缺少5′
至3′
外切酶活性。
本公开中使用的dna聚合酶的实例包括bst dna聚合酶、phi29 dna聚合酶、klenow dna聚合酶、vent dna聚合酶、deep vent dna聚合酶以及它们的突变体和工程化变体。
85.可以添加在反应混合物中的逆转录酶包括但不限于来自莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)和禽成髓细胞瘤病毒的逆转录酶、warmstart rtx逆转录酶以及它们的突变体和工程化变体。
86.反应增强添加剂(例如,dmso、甜菜碱)可以添加在反应混合物中。
87.在本公开的一个实例中,
lamp反应混合物包含f3和b3引物各
0.2μm、fip和bip引物各
1.6μm、0.4μm的
loopf引物、0.4m甜菜碱、8mm mgso4、1.4mm dntp、1×thermopol
反应缓冲液(new england biolabs,ipswich,ma.)、0.32u bst dna聚合酶(new england biolabs,ipswich,ma.)、7.5u warmstart rtx逆转录酶(new england biolabs,ipswich,ma.)以及
10μl生物样品。
可以使用实验室级别的水将
lamp反应混合物加到
25μl的体积。
在一些实施方案中,
1xcolorimetric lamp master mix(new england biolabs,ipswich,ma.)可以用于在
lamp反应混合物中包含ph指示剂。
88.可以将
lamp反应混合物在适合dna聚合酶和逆转录酶活性的温度下温育以产生温育混合物。
温度取决于所用的特定酶和期望靶标的核苷酸序列。
可以将反应混合物在适当温度下温育适合产生扩增核酸的时间。
反应时间取决于反应条件。
一般来说,反应温度可以在约
60-65℃
的范围内,但是根据每个
lamp反应物可以更高或更低。
一般来说,反应时间可以在约
30-60
分钟的范围内,但是可以更长或更短,这取决于包含待分析样品中模板核酸的量等因素。
89.成功
lamp反应的检测
90.在本公开中,成功
lamp扩增的检测可以通过检测浊度、荧光和/或比色变化来实现。
一般来说,添加样品的
lamp反应混合物可以与阳性和/或阴性对照进行比较。
91.在一些实施方案中,ph指示剂可以用于检测
lamp扩增期间释放的质子。
使用的ph指示剂可以是比色或荧光染料,根据接触流体的ph改变视觉特效,如其发射和/或吸收波长。ph指示剂的实例包括荧光素、pyranine、phrodo染料(thermo fisher scientific,waltham,ma)和中性红。
测量温育混合物的浊度、荧光和/或比色变化中的一个或多个可以产生结果(例如,阳性、阴性),其中该结果可以基于浊度、荧光和/或颜色的变化。
例如,浊度、荧光和/或颜色的变化可能表示阳性结果(例如,成功的
lamp反应),而浊度、荧光和/或颜色没有(或最小)变化可能表示阴性结果(例如,不成功的
lamp反应)。
根据一些实施方案,阳性结果可能表明存在靶核苷酸序列(例如,引物靶向的序列)。
92.利用
lamp的筛查试剂盒
93.本公开提供试剂盒(例如,筛查试剂盒),根据一些实施方案,其可以在单一过程中结合靶序列的扩增和结果的检测。
例如,如果样品中可能存在特定的靶序列并被扩增,反应混合物可能会变色。
试剂盒(例如,筛查试剂盒)可以包括组分的任何组合,所述组分包括反应管、引物、一个或多个阳性对照、一个或多个阴性对照以及一个或多个ph指示剂(例如,比色指示剂)。
本领域的普通技术人员很容易认识到,管可以包括能够容纳本文所述化学反应的任何容器、隔间等。
94.在一个样本实施方案中,试剂盒可以包含:两个反应管,每个包含不同的引物组;阳性对照;和阴性对照。
在一些实施方案中,至少一个组分可以是冷冻干燥的,从而该组分可以在货架上稳定。
在一个样本实施方案中,每个包含引物的反应管可以是冷冻干燥的。
本公开的试剂盒(例如,筛查试剂盒)可以包含本文公开的任何一个或多个(例如,组合的)单独引物或引物组。
95.阳性对照可以包含fip、bip、f3、b3、loop-f引物的任何变化,具有链置换活性的dna,dntp和ph指示剂。
在一些实施方案中,阳性对照可以包含与靶核苷酸序列基本上相同的合成核苷酸序列。
阴性对照可以包含fip、bip、f3、b3、loop-f引物的任何变化,具有链置换活性的dna,dntp和ph指示剂。
96.实施例
97.本公开的一些具体实例实施方案可以通过本文提供的一个或多个实施例来说明。
98.实施例1:设计
lamp反应的特异性引物组
99.使用引物设计工具设计靶基因变体/冠状病毒基因组特异性的外侧引物(f3和b3)、正向内侧引物(fip)、反向内侧引物(bip)和环引物(loopf)。
这个实施例中使用的特异性引物组的序列如下所示。fip和bip引物中的符号
“‑”
代表与靶基因变体/冠状病毒基因组特异性杂交的第一和第二序列的连接处。
图1中包括最终引物结构。
靶向rs429358(apoe)变体的
lamp引物组的实例可以在seq id no“1-5”中列出。
100.实施例2:靶dna的
lamp扩增
101.检测rs429358(apoe)的rt-lamp反应可以在
25μl体积中进行,包含以下组分:f3和b3引物各
0.2μm、fip和bip引物各
1.6μm、0.4μm的
loopf引物、0.4m甜菜碱、8mm mgso4、1.4mm dntp、colorimetric lamp master mix(new england biolabs,ipswich,ma.)、0.32ubst dna聚合酶(new england biolabs,ipswich,ma.)、7.5u warmstart rtx逆转录酶(new england biolabs,ipswich,ma.)以及
10μl生物样品。rt-lamp扩增可以利用pcr系统(applied biosystems,foster city,calif.)进行。
反应混合物可以在
60℃
下加热
60
分钟。
每次运行中包括阴性对照,包括仅引物对照和/或水对照。
通过添加合成的snp dna也可以包括阳性对照。
详细的反应流可以在图2中说明。
102.本领域技术人员可以在不脱离本公开范围的情况下做出各种改变。
每个公开的方法和方法步骤可以与任何其他公开的方法或方法步骤相关联并根据一些实施方案的任何顺序进行。
当动词“可以”出现时,它可能意在表达一种任选存在和/或允许的条件,但是除非另有说明,否则它的使用可能并不意味着任何缺乏可操作性。
本领域技术人员可以对制备和使用本公开的组合物、装置和/或系统的方法做出各种改变。
如有需要,可以实施本公开的一些实施方案以排除其他实施方案。
103.此外,在已提供范围的情况下,公开的端点可以按照特定实施方案的期望或要求作为精确和/或近似值处理(例如,不读或读“约”)。
在端点近似的情况下,灵活性的程度可以与范围的数量级成比例变化。
例如,一方面,在约5至约
50
的范围内,约
50
的范围端点可以包括
50.5,但不包括
52.5或
55,另一方面,在约
0.5至约
50
的范围内,约
50
的范围端点可以包括
55,但不包括
60

75。
在一些实施方案中,变化可以简单为规定值的
/-10%。
此外,在一些实施方案中,混合和匹配范围端点可能是可取的。
而且,在一些实施方案中,公开的每个数字(例如,在一个或多个实例、表格和/或附图中)可以构成范围(例如,所示值
/-约
10%,
所示值
/-约
50
%,所示值
/-约
100
%)和/或范围端点的基础。
关于前者,在实例、表格和/或附图中示出的值
50
可以构成例如约
45至约
55、约
25至约
100
和/或约0至约
100
的范围的基础。
104.这些等同物和替代物以及明显的变化和修改都意图包括在本公开的范围内。
因此,前述公开可能是为了说明所附权利要求说明的公开范围,而不是为了限制。
题目、摘要、背景和标题均按照规定和/或为了方便读者而提供。
它们不包括对现有技术范围和内容的承认,也不包括适用于所有公开的实施方案的限制。
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