一种抗百草枯纳米抗体及其应用-尊龙凯时官方app下载

文档序号:36401367发布日期:2023-12-16 04:27阅读:15来源:国知局


1.本发明属于免疫学技术领域,更具体地,涉及一种抗百草枯纳米抗体及其应用



背景技术:

2.百草枯
(paraquat,ph)
是一种水溶性的高效

非选择性的季铵盐除草剂,自
1962
年以来被广泛用于农业

据报道,
ph
具有神经毒性,会对多巴胺能神经元造成不可逆的损伤;这种损伤与神经退行性疾病的风险增加有关,如帕金森病

阿尔茨海默病

此外,动物研究表明
ph
可能导致线粒体功能障碍,这是由线粒体电子运输中断引起的

百草枯的滥用提高了其在土壤



食品中的含量,自
2007
年7月起,欧盟禁止使用
ph
,但在非欧洲国家仍广泛使用
ph
,中国对农产品中百草枯的最大残留量进行了规定,

食品安全国家标准食品中农药最大残留限量
》(gb 2763—2021)
对各类食品中百草枯的最大限量范围为
0.005

2mg/kg。
中国是
ph
的最大生产国,每年生产超过
10
万吨
ph
,其产量每年都在增加

为了保护人类免受
ph
暴露,迫切需要开发可靠

快速的分析方法

3.目前,用于识别和检测
ph
的分析方法,如分光光度法

气相色谱法

液相色谱法

薄层色谱法

质谱法

电化学法和电泳法

虽然这些技术可以有效地用于
ph
检测,并具有高选择性和高灵敏度,但它们都需要借助精密设备开展监测,无法现场出具检测结果,不利于执法监督

由于快速,操作简单

低成本等优势,酶联免疫吸附测定分析方法
(elisa)
和胶体金免疫分析方法
(gica)、
时间分辨荧光微球
(trfms)
被广泛应用于
ph
快速检测

虽然
elisa
灵敏度高

特异性强

重复性好,但需要借助光学仪器判读结果

抗原抗体孵育时间较长

操作步骤繁琐,限制了其在现场快速检测的应用

胶体金
(colloidal gold)
是目前最常用的层析方法,具有
cg
具有制备简单

颜色鲜艳

成本低的优点,然而,纳米粒子在生物分析过程中也会遇到一些关键问题,例如它们容易聚集

在复杂溶液中不稳定以及缺乏生物相容性,导致检测灵敏度低,容易出现假阴性

由于上述的免疫分析方法在检测范围方面存在一定的限制,无法满足国家最大残留限量浓度宽范围的需求,这无异于会增加样品前处理的难度和降低方法的准确度

因此,探索一种简单

快速

可实现宽线性范围的免疫分析方法用于百草枯检测是必要的和紧迫的

4.微流控芯片是芯片实验室重要组成成分之一,是一种能在宽度为微米级的通道内精确处理微量液体的技术,具有试剂微量化

高敏感

高通量

自动化等优势

微流控芯片多通道和多反应的结构特点为芯片上免疫反应提供了优越平台,有望在其的基础上开发新方法满足简单

快速

宽线性范围的检测需求

免疫检测技术关键仍在于抗原与抗体的特异性结合,因此提供一种适合应用于微流控芯片的抗体对提高微流控免疫检测的效果也十分重要

目前未见有适用于百草枯微流控免疫检测技术的抗体,亟需提供一种用于百草枯微流控免疫检测的抗百草枯抗体以及基于该抗体建立的微流控免疫检测方法



技术实现要素:

5.本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足,提供一种抗百草枯纳
米抗体及其应用

6.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的:
7.本发明首先提供一种抗百草枯的纳米抗体,所述纳米抗体
nb2-34

vhh
的氨基酸序列如
seq id no.1
所示,所述纳米抗体是以百草枯人工抗原作为免疫原免疫动物得到的

8.进一步地,所述纳米抗体为将通过合成百草枯半抗原
ph-q
,制备百草枯人工抗原,将其作为免疫原免疫骆驼,通过羊驼免疫后,经过羊驼血清鉴定,分离淋巴细胞,提取
rna
,扩增目的基因,进行酶切与酶联反应,将酶联产物经过多次电转至感受态
e.coli tg1
,获得纳米抗体基因文库,经辅助噬菌体救援后,得到的噬菌体展示纳米抗体文库

通过生物淘筛,从羊驼免疫抗体文库中筛选得到能与百草枯特异性结合的纳米抗体,将其命名为
nb2-34。
9.进一步地,所述百草枯半抗原
ph-q
结构式如式(i)所示:
[0010][0011]
本发明提供所述百草枯半抗原在制备百草枯人工抗原或抗体中的应用

[0012]
进一步地,所述百草枯人工抗原结构式如式
(ⅱ)
所示:
[0013][0014]
进一步地,所述百草枯人工抗原的制备方法,由上述百草枯半抗原
ph-q
与载体蛋白偶联制备得到

[0015]
优选地,所述载体蛋白为卵清白蛋白
(ova)、
刀豆球蛋白
a(cona)。
[0016]
进一步优选地,所述载体蛋白为
cona。
[0017]
进一步地,所述百草枯人工抗原的制备方法为采用活泼酯法将半抗原
ph-q
与载体蛋白偶联制备得到,所述制备方法为:先将百草枯半抗原
ph-q
溶于
dmf
中,加入
edc

nhs
搅拌反应活化,记为a液,再将载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中,记为b液,
a、b
液混合搅拌反应,反应后于
4℃
下透析3天,得到人工抗原
ph-q-ova、ph-q-con a。
[0018]
优选地,所述半抗原与载体蛋白的摩尔比均为
60

1。
[0019]
优选地,半抗原
ph-q、nhs

edc
的投料摩尔比为1:
1.5

1.5。
[0020]
本发明提供所述人工抗原在制备抗百草枯抗体中的应用

[0021]
进一步地,所述抗百草枯抗体可为纳米抗体

多克隆抗体或纳米抗体等

[0022]
优选地,所述抗百草枯抗体为纳米抗体

[0023]
进一步地,编码所述纳米抗体
nb2-34
的基因的核苷酸序列如
seq id no.2
所示

[0024]
因此,本发明还提供一种重组载体,所述重组载体含有上述基因

[0025]
本发明还提供一种重组细胞,所述细胞含有上述重组载体

[0026]
由于本发明已给出了纳米抗体
nb2-34
的氨基酸序列和编码该纳米抗体的基因序列,本领域技术人员可在此基础上通过已知的重组
dna
技术得到本技术所述纳米抗体

因此,任何可用于制备本发明所述纳米抗体的重组载体或重组细胞等也应在本发明的保护范围之内

[0027]
本发明还提供所述纳米抗体在检测百草枯中的应用

[0028]
本发明还提供所述纳米抗体

所述基因

所述重组载体或所述重组细胞在制备检测百草枯产品中的应用

[0029]
本发明还提供一种检测百草枯的方法,所述方法为百草枯半抗原与载体蛋白偶联得到的人工抗原
ph-q-ova
做包被原,用所述纳米抗体作为检测抗体进行检测

[0030]
进一步地,所述载体蛋白为卵清蛋白

[0031]
本发明还提供一种检测百草枯的开放式液滴阵列微流控芯片,包括上述百草枯人工抗原和上述抗百草枯的纳米抗体作为检测抗原和抗体

[0032]
进一步地,所述开放式液滴阵列微流控芯片包括芯片基底和位于芯片基底上的若干个平行通道,每个平行通道设有通过微流控通道狭缝依次相连的第一反应腔室

第二反应腔室

第三反应腔室和尾腔室,每个腔室均具有凹陷微结构;所述第一反应腔室用于装载待测样品

磁珠抗原和酶标抗体混合溶液;所述第二反应腔室用于装载缓冲盐溶液;所述第三反应腔室用于装载荧光探针溶液

[0033]
进一步地,所述磁珠抗原为上述百草枯人工抗原与磁珠偶联物;所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的上述抗百草枯的纳米抗体;所述缓冲盐溶液为
pbs
溶液;所述荧光探针溶液为
amplex red/h2o2。
[0034]
优选地,所述磁珠抗原为百草枯人工抗原与
nhs
磁珠偶联物

[0035]
优选地,所述百草枯人工抗原中的载体蛋白为卵清白蛋白
(ova)
,所述抗原为
ph-q-ova。
[0036]
优选地,所述平行通道为
15


[0037]
优选地,所述平行通道间距离为
5.0mm
;连接反应腔室的微流控通道狭缝宽
0.5mm。
[0038]
本发明还提供所述开放式液滴阵列微流控芯片在检测百草枯中的应用

[0039]
本发明还提供一种用于检测百草枯的微流控免疫检测试剂盒,所述试剂盒含有上述所述磁珠抗原和上述所述酶标抗体

[0040]
进一步地,所述试剂盒还包括上述开放式液滴阵列微流控芯片

[0041]
进一步地,所述试剂盒还包括
pbs
溶液
、amplex red/h2o2液

[0042]
本发明还提供一种检测百草枯的微流控免疫检测方法,通过将酶标抗体与磁珠抗原混合,再加入待测溶液,利用直接竞争法,结合凝胶成像,实现对标志物的特异性识别

[0043]
进一步地,所述方法为:将游离的待检溶液与磁珠抗原

酶标抗体混合在上述开放式液滴阵列微流控芯片的的第一反应腔室中,在磁铁的牵引下,结合了酶标抗体的磁珠抗原与未结合的磁珠抗原依次进入第二

三反应腔室,在第三反应腔室中结合了酶标抗体的磁珠抗原催化
h2o2与底物
amplex red
反应生成荧光物质试卤灵
(resorufin)
产生信号输出,根据凝胶成像仪
(520nm)

image j
软件处理荧光信号进行定量检测

经检验,基于
nhs
磁珠-微流控的免疫检测方法对百草枯的检测限为
0.0028ng/ml
,线性范围为
0.064

1000ng/ml。
[0044]
因此,本发明还提供上述检测方法在农药残留检测领域的应用

[0045]
优选地,所述农药为百草枯

[0046]
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
[0047]
本发明提供一种抗百草枯纳米抗体,首先通过人工合成百草枯半抗原
ph-q
,利用该百草枯半抗原与
cona
偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫骆驼,通过羊驼免疫后,获得纳米抗体基因文库,经辅助噬菌体救援后,得到的噬菌体展示纳米抗体文库

通过生物淘筛,从羊驼免疫抗体文库中筛选得到能与百草枯特异性结合的纳米抗体
nb2-34
,在抗百草枯纳米抗体
nb2-34
基础上,本发明进一步提供一种检测百草枯的
nhs
磁珠-微流控免疫检测方法,该方法操作简单,快速,结果准确可靠,灵敏度高,对百草枯的检测限为
0.0028ng/ml
,线性范围为
0.064

1000ng/ml
,可实现国家标准中最大残留限量浓度范围的广泛检测

附图说明
[0048]
图1为载体蛋白
(ova、cona)、ph-q
以及人工抗原
ph-q-ova

ph-q-cona
的紫外扫描图

[0049]
图2是纳米抗体
nb2-34
的氨基酸编号及结构域示意图

[0050]
图3为基于抗百草枯纳米抗体
nb-2-34
建立的间接竞争
elisa
标准曲线图

[0051]
图4为开放式液滴阵列微流控芯片示意图;a为芯片制作流程,b为芯片详细尺寸图

[0052]
图5为基于
nhs
磁珠-微流控免疫检测方法检测百草枯建立的标准曲线图

具体实施方式
[0053]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定

除非特别说明,本发明采用的试剂

方法和设备为本技术领域常规试剂

方法和设备

[0054]
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购

[0055]
实施例1百草枯人工抗原的制备
[0056]
1、
实验方法
[0057]
本发明所用半抗原的结构式如式
(ⅰ)
所示:
[0058][0059]
采用活泼酯法将百草枯半抗原
ph-q
与载体蛋白偶联卵清白蛋白
(ova)、
刀豆球蛋白
a(con a)
制备得到,所述制备方法为:
[0060]
将百草枯半抗原
ph-q
溶于
dmf
中,加入
edc

nhs edc(
摩尔比
ph-q

nhs

edc
=1:
1.5

1.5)
搅拌反应活化
8h
,记为a液,再将载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中,记为b液,
a、b
液混合搅拌反应
8h
,反应后于
4℃
下透析3天,透析后得到人工抗原
ph-q-ova、ph-q-cona
,其结构式如式
(ⅱ)
所示:
[0061][0062]
其中,载体蛋白为卵清白蛋白
(ova)、
刀豆球蛋白
a(con a)。
[0063]
2、
实验结果
[0064]
对载体蛋白
(ova、cona)、ph-q
以及人工抗原
ph-q-ova

ph-q-cona
进行紫外扫描鉴定
(150

450nm)
,结果如图1所示,制备得到的人工抗原与载体蛋白
(ova、cona)、ph-q
相比特征吸收峰有明显的蓝移,且人工抗原具备半抗原
ph-q
和载体蛋白
(ova、cona)
的特征吸收峰,说明人工抗原制备成功

[0065]
实施例2抗百草枯纳米抗体的制备
[0066]
1、
实验方法
[0067]
(1)
动物免疫:用健康的羊驼作为实验动物,以
ph-q-cona
作为免疫原,在羊驼背颈部进行皮下注射,每次免疫剂量为
0.5ml(
其中含有
0.5mg
免疫原
)。
首次免疫用
0.5ml
完全弗氏佐剂与抗原乳化后用于免疫,4周后用
0.5ml
不完全弗氏佐剂与抗原乳化后加强免疫,之后每间隔2周加强免疫一次

免疫前取
10ml
血分离血清作为阴性对照

从第二次免疫开始,每次取免疫一周后的血液
10ml
进行血清效价以及竞争反应检测

当出现较好的免疫应答效果时,取血
100ml
外周血进行淋巴细胞的分离,用于构建纳米抗体文库

[0068]
(2)
羊驼淋巴细胞的分离:取羊驼全血与等体积生理盐水混合成
1:1
稀释血液,常温放置

在无菌的
50ml
离心管中加入
20ml
的淋巴分离液,用无菌巴氏滴管沿着试管壁缓慢加入
20ml
的稀释血液
。500g
离心
30min。
取淋巴细胞层到新的
50ml
离心管,用生理盐水稀释2倍,
4℃
条件下
2000g
离心
10min
,弃上清


5ml
生理盐水吹散淋巴细胞,再次
2000g
离心
10min
,弃上清,以充分洗涤淋巴细胞

每份淋巴细胞中加入裂解液
(trnsol)

1ml
一份分装到
2ml
离心管中,于-80℃
保存备用

[0069]
(3)

rna
的提取:总
rna
的提取依据
invitrogen
公司的
trizol
试剂方法进行

具体方法如下:
[0070]
将上述裂解液每
1ml
加入
0.2ml
的氯仿

盖上离心管盖子,剧烈震荡
15
秒,在冰上孵育
5min。
室温下
12000rpm
离心
10min。
转移不多于
80
%上层水相至新的离心管,缓慢加入
0.7
倍体积的无水乙醇,混匀;将得到溶液和沉淀一起转入
gbc
吸附柱中,
12000rpm
离心
30
秒,弃废液;向
gbc
吸附柱中加入
500
μ
lwash buffer i
离心
1min
,弃废液;向
gbc
吸附柱中加入
600
μ
l wash buffer ii

12000rpm
,离心
30
秒,弃废液
。12000rpm
离心
1min
,弃废液,室温打开盖子晾干吸附柱中残留漂洗液


gbc
吸附柱转入一个新的离心管中,加入
30

100
μ
l ddh2o
,室温放置
2min

4℃

12000rpm
离心
1min。
收集管内液体,于-80℃
保存

[0071]
(4)cdna
的合成:以
rna
为模板,参照
takara
公司第一链反转录试剂盒说明书进行
cdna
第一链的合成

具体方法为:
[0072]
a.
按照表1所示的
cdna
合成的第一步反应体系,将试剂在无核酸酶的离心管中混合,在冰浴下操作;
[0073]

1 cdna
合成的第一步反应体系
[0074]
total rna3
μ
goligo(dt)
18 primer1
μ
lrnase free ddh2oup to12
μ
ltotal12
μ
l
[0075]
b.
上述反应体系
65℃
孵育
5min
,冰浴冷却
2min

[0076]
c.
按照表2所示的
cdna
合成的第二步反应体系,在步骤a反应后的体系中加入试剂;
[0077]

2cdna
合成的第二步反应体系
[0078]
步骤a反应后的体系
12
μ
l5
×
reaction buffer4
μ
lribolock rnase inhibitor(20u/
μ
l)1
μ
l10mm dntp mix2
μ
lrevertaid m-milvrt(200u/
μ
l)1
μ
ltotal20
μ
l
[0079]
d.42℃
孵育
60min

70℃
孵育
5min。
反转录产物
cdna
于-80℃
保存

[0080]
(5)
纳米抗体
vhh
目的基因的扩增
[0081]
第一轮
pcr
:将步骤
(5)
得到的反转录产物
cdna
作为模板,利用引物
q1/q2
进行第一轮
pcr
反应,引物
q1/q2
的核苷酸序列如表5中的
seq id no.10

11
所示,第一轮
pcr
的反应体系如表3所示

[0082]
表3第一轮
pcr
的反应体系
[0083][0084]
第一轮
pcr
的反应条件为:
94℃5min

94℃30s

55℃30s

72℃1min 30cycle

72℃10min。
[0085]
第二轮
pcr
:采用试剂盒回收第一轮
pcr
反应产物,适当稀释后作为第二轮
pcr
的模板,利用引物
q3/q4
或引物
q3/q5
进行第二轮
pcr
反应,引物
q3/q4
的核苷酸序列如表5中的
seq id no.12

13
所示,引物
q3/q5
的核苷酸序列如表5中的
seq id no.12

seq id no.14
所示,第二轮
pcr
的反应体系如表4所示

[0086]
表4第二轮
pcr
的反应体系
[0087]
[0088][0089]
第二轮
pcr
的反应条件为:
94℃5min

94℃30s

55℃30s

72℃1min 30cycle

72℃10min。
[0090]
表5纳米抗体
vhh
目的基因的扩增所用的引物及其核苷酸序列
[0091]
q1(seq id no.10)5
′‑
gtcctggctgctcttctacaagg-3

q2(seq id no.11)5
′‑
ggtacgtgctgttgaactgttcc-3

q3(seq id no.12)5
′‑
catgccatgactgtggcccaggcggcccagktgcagctcgtggagtc-3

q4(seq id no.13)5
′‑
catgccatgactcgcggccggcctggccatgggggtcttcgctgtggtgcg-3

q5(seq id no.14)5
′‑
catgccatgactcgcggccggcctggccgtcttgtggttttggtgtcttggg-3

[0092]
(6)
文库构建
[0093]
a.vhh
目的基因及载体的酶切
[0094]
采用
sfi i
酶对
vhh
目的基因及
pcomb3xss
载体进行酶切

酶切条件:
50℃
水浴锅反应
16h。
[0095]
b.
酶切产物的连接
[0096]
将载体
pcomb3xss

vhh
片段混匀
(
摩尔比1:
3)
,于
16℃
连接反应
16h
后用试剂盒清洁回收

[0097]
c.
电转化
[0098]
取5μ
l
连接产物加至
50
μ
l
电转感受态
e.coil tg1
中,轻轻混匀后转入
0.1cm
的电转杯中电击转化
(
电压为
1.8kv)
,立即向电转杯加入
950
μ
l soc
培养基,
37℃

250rpm
培养
1h
,将菌液涂布于
lb-amp
平板,
37℃
倒置培养过夜

[0099]
(7)
文库的救援
[0100]
接种超过
10
倍库容量的细胞于
200ml lb(amp)

37℃

250rpm
培养至
od
600

0.4

0.6
;加入辅助噬菌体m13k07
(20:1
感染复数
)

37℃
静置
30min
后,
250rpm
培养
1h
,加入卡那抗生素
(1

1000)37℃

250rpm
培养过夜
。12000rpm 4℃15min
离心,取上清,加入
1/5
体积的
peg/nacl
,冰浴2~
3h。12000rpm 4℃15min
离心,弃上清,沉淀用
1ml tbs
重悬,转移到
2ml
离心管,
12000rpm 4℃5min
离心,过
0.22
μm聚醚砜滤膜,取
10
μ
l
测定库容,其余加入终浓度
50
%甘油,-80℃
保存

[0101]
实施例3纳米抗体的亲和淘选及其鉴定
[0102]
(1)
纳米抗体的亲和淘选
[0103]
首先,以
ph-q-ova
作为包被原,用包被液将
ph-q-ova
包被原稀释至终浓度
10
μ
g/ml

37℃
包被过夜

第二天用
pbst(0.01m pbs

0.06

tween-20(v/v))
洗两次后,加入1%鱼胶蛋白
37℃
封闭
2h。
甩干孔内液体并拍干,每孔加入
100
μ
l
噬菌体文库
(
文库滴度约为
10
12
cfu/ml)

37℃
孵育
1h。
弃去未结合的噬菌体,用
pbst(0.01m pbs

0.05

tween-20(v/v))
洗涤5次,
pbs(ph 7.0)
洗涤
15
次,加入
gly-hcl(0.2m

ph 2.2)37℃
洗脱
10min
,立即用
10
μ
l tris-hcl(1m

ph 9.0)
中和


10
μ
l
洗脱噬菌体测定滴度,其余的用于感染
4ml
生长至对数期的
e.coil tg1
菌株进行扩增

第三天用
peg/nacl
沉淀扩增后噬菌体,并测定噬菌体的滴度

[0104]
在第二



四轮的淘选过程中,包被的
ph-q-ova
包被原浓度为2μ
g/ml、0.4
μ
g/ml、0.25
μ
g/ml
,加入噬菌体孵育
1h
,用
pbst(0.01m pbs

0.05

tween-20(v/v))

pbs
洗涤后,采用药物竞争洗脱方式,即加入一定浓度的药物,
37℃
孵育
1h
,吸出孔内液体,即为洗脱下来的噬菌体

其余步骤同上

药物洗脱浓度分别
1000ng/ml、400ng/ml、100ng/ml。
[0105]
(2)
阳性噬菌体克隆的鉴定
[0106]
采用间接酶联免疫吸附法进行阳性噬菌体克隆的鉴定,具体方法为:
[0107]
a.
包板:用包被液将
ph-q-ova
包被原稀释至1μ
g/ml

37℃
包被过夜

第二天用
pbst(0.01m pbs

0.06

tween-20(v/v))
洗两次后,加入2%的脱脂奶粉,每孔
120
μ
l

37℃
封闭
3h
,弃封闭液,
37℃
烘干
60min
,用密封袋装于
4℃
待用

[0108]
b.
从第三

四轮淘选后测定滴度的平板上随机挑选
30
个克隆于加有
amp
抗性的
lb
培养基的
96
孔深孔板中,同时接种一个
tg1
单克隆作为阴性对照,
37℃
培养过夜

第二天从
96
孔深孔板中取出
10
μ
l
菌液加入到另一块
96
孔深孔板,
37℃

180rpm
培养
2h
,每孔加入
iptg(1

1000
比例,
v/v)37℃

180rpm
培养过夜

第三天
4000rpm
离心取上清
100
μ
l
,加入到已经包被好的酶标板中,
37℃
孵育
40min
,用
pbst(0.01m pbs

0.06

tween-20(v/v))
洗五次,拍干孔内液体,加入
1:5000
稀释
hrp
标记的抗
ha
二抗
100
μ
l

37℃
孵育
40min
,用
pbst(0.01m pbs

0.06

tween-20(v/v))
洗五次,拍干孔内液体,加入
100
μ
ltmb
底物液,
37℃
避光显色
10min
;加入
50
μ
l
终止液
(2m h2so4)
终止反应;用酶标仪测定
450nm
处的吸收值

选取
od
450
大于阴性3倍的噬菌体克隆为阳性克隆

[0109]
(3)
纳米抗体的鉴定
[0110]
采用间接竞争
elisa
的方法进行阳性纳米抗体的鉴定,具体方法为:
[0111]
用包被液将
ph-q-ova
包被原稀释至1μ
g/ml

37℃
包被过夜

第二天用
pbst(0.01m pbs

0.06

tween-20(v/v))
洗两次后,加入2%的脱脂奶粉,每孔
120
μ
l

37℃
封闭
3h
,弃封闭液,
37℃
烘干
60min
,用密封袋装于
4℃
待用

加入效价组:
50
μ
l
经间接
elisa
鉴定为阳性克隆的上清液和
50
μ
l

pbs
;抑制组:
50
μ
l
经间接
elisa
鉴定为阳性克隆的上清液和
50
μ
l
的百草枯标准品
(
浓度为1μ
g/ml)

37℃
孵育
40min
,用
pbst(0.01m pbs

0.06

tween-20(v/v))
洗五次,拍干孔内液体,加入
1:5000
稀释
hrp
标记的抗
ha
二抗
100
μ
l

37℃
孵育
40min
,用
pbst(0.01m pbs

0.06

tween-20(v/v))
洗五次,拍干孔内液体,加入
100
μ
l tmb
底物液,
37℃
避光显色
10min
;加入
50
μ
l
终止液
(2mh2so4)
终止反应;用酶标仪测定
450nm
处的吸收值

[0112]
结果显示:获得了一株能够特异性识别百草枯的纳米抗体,命名为
nb2-34。
[0113]
实施例4纳米抗体
nb2-34
编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
[0114]
1、
实验方法
[0115]
将经过间接竞争
elisa
鉴定获得的纳米抗体
nb2-34
的菌株送到测序公司进行测序,获得纳米抗体
nb2-34
的核苷酸序列;根据
dna
测序结果及密码子表,获得纳米抗体
nb2-34
的氨基酸序列

[0116]
2、
实验结果
[0117]
纳米抗体
nb2-34

vhh
的氨基酸序列如
seq id no.1
所示:
[0118]
evqlvesggalvqpggslrlscevsveissantmgwyrrapgkqielvaaidsngraaypdsvtgrftisrdnannvidlqmnslrpsdtavyycnvwwdllrdywgrgtqvtvssahhsedph
[0119]
编码所述纳米抗体
nb2-34
的基因的核苷酸序列如
seq id no.2
所示:
[0120]
gaggtgcagctggtggagtctggtggagcattggtgcagcctggggggtctttgagactctcctgtgaggtctctgtggagatatcgagtgccaacactatgggctggtaccgccgggctccggggaagcagattgagctggtcgcggccattgatagtaacggaagagcggcctatccggactccgtgacgggccgattcaccatctccagagacaacgctaacaacgtgatcgatctgcaaatgaacagcctgagaccatcagacacggccgtctattattgtaatgtctggtgggatctcttgagggactactggggccgggggacccaggtcaccgtctcctcagcgcaccacagcgaagacccccat
[0121]
纳米抗体
nb2-34
的氨基酸编号及结构域示意图如图2所示,可以看出,该纳米抗体
nb2-34
包括4个框架区
(framework region,fr)
和3个互补决定区
(complementarity-determining region,cdr)
;框架区
(fr1-fr4)
分别选自
seq id no.3

seq id no.4

seq id no.5

seq id no.6
;互补决定区
(cdr1-cdr3)
分别选自
seq id no.7

seq id no.8

seq id no.9。
[0122]
其中,第
1-25
位氨基酸序列为
fr1
,其氨基酸如
seq id no.3
所示:
evqlvesggalvqpggslrlscevs
;第
26-33
位氨基酸序列为
cdr1
,其氨基酸如
seq id no.7
所示:
veissant
;第
34-50
位氨基酸序列为
fr2
,其氨基酸如
seq id no.4
所示:
mgwyrrapgkqielvaa
;第
51-57
位氨基酸序列为
cdr2
,其氨基酸如
seq id no.8
所示:
idsngra
;第
58-95
位氨基酸序列为
fr3
,其氨基酸如
seq id no.5
所示:
aypdsvtgrftisrdnannvidlqmnslrpsdtavyyc
;第
96-105
位氨基酸序列为
cdr3
,其氨基酸如
seq id no.9
所示:
nvwwdllrdy
;第
106-124
位氨基酸序列为
fr4
,其氨基酸如
seq id no.6
所示:
wgrgtqvtvssahhsedph。
[0123]
实施例5纳米抗体
nb2-34
的大量制备
[0124]
以蛋白表达的形式进行制备纳米抗体
nb2-34
,具体方法为:
[0125]
将所获得的纳米抗体
nb2-34
的菌株,用试剂盒提取其质粒,将质粒用化学转化的方法转入
e.coil bl21


从转化平板上挑一单菌落接种于
10ml lb(amp)
培养基中,
37℃

250rpm
培养过夜

将过夜培养物按1:
100
的比例接种于
1000ml lb(amp)
培养基中,
37℃

250rpm
培养至
od
600
约为
0.4

0.6
时,加入
iptg(1:1000
比例,
v/v)

37℃

250rpm
培养过夜

第二天
4℃

12000rpm
离心
5min
,收集菌体沉淀,用蔗糖渗透压冻融法,
12000rpm
离心
10min
,取上清,将上清进行亲和层析纯化,即得表达的纳米抗体
nb2-34。
[0126]
实施例6利用纳米抗体
nb-2-34
检测百草枯
[0127]
1、
包被及封闭
[0128]
用包被液将
ph-q-ova
包被原稀释至1μ
g/ml

37℃
包被过夜

第二天用
pbst(0.01mpbs

0.05

tween-20(v/v))
洗板两次后,加入1%鱼胶蛋白溶液,每孔
120
μ
l

37℃
封闭
3h
,弃封闭液,
37℃
烘干
1h
,用密封袋装于
4℃
待用

[0129]
2、
检测百草枯
[0130]
(1)
实验方法
[0131]
用包被液将
ph-q-ova
包被原稀释至1μ
g/ml

37℃
包被过夜

第二天用
pbst
(0.01mpbs

0.05

tween-20(v/v))
洗板两次后,加入
120
μ
l/
孔2%的脱脂奶粉溶液,
37℃
封闭
3h
,弃封闭液,
37℃
烘干
1h。
每孔加入
50
μ
l
纳米抗体和一系列不同浓度的
50
μ
l
的百草枯标准品,
37℃
条件下孵育
40min
,用
pbst
洗板五次,拍干孔内液体,加入
1:5000
稀释的
hrp
标记的抗
vhh
二抗
100
μ
l

37℃
孵育
30min
,用
pbst
洗板五次,拍干孔内液体,加入
100
μ
l tmb
底物液,
37℃
避光显色
10min
;加入
50
μ
l
的终止液
(10
% h2so4,
v/v)
终止反应;用酶标仪读取
450nm
处的吸收值

以百草枯标准品的浓度为横坐标,
b/b0(
百草枯
)
的孔的
od
450
/
未加入百草枯的孔的
od
450
为纵坐标,建立间接竞争标准曲线

[0132]
(2)
实验结果
[0133]
基于纳米抗体
nb-2-34
建立的间接竞争
elisa
标准曲线图如图3所示,由图可以看出,标准曲线呈s型,线性相关性较好,针对百草枯的半数抑制
(ic50)
分别为
1.23ng/ml
,线性范围分别为
0.17

8.66ng/ml。
[0134]
实施例7一种检测百草枯的开放式液滴阵列微流控芯片
[0135]
本发明所述开放式液滴阵列微流控芯片的制作,具体方法为:
[0136]
所述芯片设计图如图
4a
,采用铸模工艺制得

首先,利用
auto cad
设计液滴阵列微流控芯片,并将其转换成计算机数控加工合金模具
。pdms
前驱体以
1:10
比例的交联剂-碱制备
(sylgard 180
,道康宁公司
)。
随后将其倒入该模具中,经真空泵排气泡后,放入烘箱在
60℃
条件下烘制
3h
,再在高温下进行疏水涂层处理,从而得到液滴阵列微流控芯片

[0137]
所述芯片如图
4b
包括芯片基底和位于芯片基底上的若干个平行通道,每个平行通道通过微流控通道狭缝设有依次相连的3个反应腔室和1个尾腔室,每个腔室均具有凹陷微结构;所述芯片平行通道为
15
个;平行通道间距离为
5.0mm
;连接反应腔室的微流控通道狭缝宽
0.5mm
;第一反应腔室加入待测溶液

磁珠抗原和酶标抗体的混合溶液,第二反应腔室中加入
pbs
液滴,第三反应腔室中加入有显色底物
amplex red/h2o2液滴;所述磁珠抗原为百草枯人工抗原
ph-q-ova

nhs
磁珠偶联物;所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记实施例3所述的抗百草枯纳米抗体
nb-2-34。
[0138]
实施例8基于
nhs
磁珠的百草枯抗原-磁珠偶联物的制备
[0139]
根据
beaver beads mag nhs
的使用说明制备抗原-磁珠偶联物,具体方法为:
[0140]
1、
磁珠清洗:取
500
μ
l nhs
磁珠于
1.5ml
离心管中,再将离心管置于磁性分离架内,富集磁珠,去除上清液;加入少量预冷的
1mm
盐酸溶液,混合均匀;将离心管置于磁性分离架内,富集磁珠,去除上清液

[0141]
2、
生物配体固定:加
500
μ
l
抗原溶液
(ph-q-ova

200
μ
g/ml)
于上述离心管中与磁珠混合均匀

置于垂直混合仪上混合反应1~
2h
;采用磁性分离架富集磁珠,保存流穿液

[0142]
3、
磁珠封闭:加
500
μ
l 3m
乙醇胺于上述离心管中,洗涤磁珠4次

随后,加入
500
μ
l 3m
乙醇胺,
500
μ
l 5

bsa
于上述离心管中,于垂直混合仪中封闭反应
2h
;然后加少量超纯水于离心管中,充分混合,用磁力分离架富集磁珠,弃上清液

[0143]
4、
保存:加入少量含
0.05
%叠氮化钠的
pbs
缓冲溶液于离心管中,充分混合,用磁力架富集磁珠,弃上清液;加入少量
0.05
%叠氮化钠的
pbs
缓冲溶液于离心管中,
4℃
保存备用

[0144]
实施例9酶标抗体的制备
[0145]
本发明所述酶标抗体的制备,具体方法为:
[0146]
采用改良的过碘酸钠法制备酶标抗体
hrp-ph-nb
,具体步骤为:称取
5mg hrp
,溶解于
500
μ
l
醋酸盐缓冲液
(ph 5.6)


滴加
100
μ
l
高碘酸钠溶液,低温避光搅拌
30min。
随后,依次向混合物中加入
500
μ
l
乙二醇和
60
μ
l
纳米抗体
ph-nb(6.96mg/ml)
,各
30min。
反应结束后取出并在
cbs
溶液
(ph 9.6)
中透析过夜

将上述混合物与少量硼氢化钠溶液
(5mg/ml)
混合并反应
2h。
添加等量的饱和硫酸铵溶液以沉淀缀合物

反应
30min
,静置
1h
,低温离心
20min(4500r/min)
,留下沉淀

将沉淀用少量
pbs(ph 7.4)
溶解,装入透析袋中,在
pbs
溶液中透析过夜,收集上清即为
hrp-ph-nb。
[0147]
实施例
10
一种用于检测百草枯的
nhs
磁珠-微流控免疫检测方法
[0148]
1、
检测步骤
[0149]
首先,向每个液滴阵列微流控芯片中注入
400
μ
l
矿物油

然后,待测溶液与酶标抗体
(1:1

v/v))
的混合液
30
μ
l

pbs(0.1mol/l)

hrp-ph-nb
的混合液
(1:1

v/v))
的混合液
30
μ
l
分别添加到两个平行通道的第一反应腔室中;将
1.5
μ
l
制备好的磁珠抗原加入上述反应腔室中,
37℃
孵育
30min
;在第二反应室和第三反应腔室中分别加入
30
μ
l pbs

30
μ
l
显色液
(15
μ
l h2o2和
15
μ
l amplex red)
;将反应后的探针在磁力牵引下依次拉入第二

第三反应腔室,最后牵引至第三反应腔室于
37℃
孵育
5min
,完成免疫测定

通过凝胶成像仪
(520nm)
采集荧光信号,并利用
image j
软件对信号进行定量计算分析

[0150]
2、
标准曲线的建立
[0151]
首先按照检测步骤测定系列梯度浓度
(1000、200、40、8、1.6、0.32、0.064、0ng/ml)

ph
标准溶液

根据各标准品稀释液的浓度和灰度值拟合标准曲线,以浓度为横坐标,灰度值的差值为纵坐标

[0152]
3、
定量分析
[0153]
使用凝胶成像仪采集荧光信号,并利用
image j
软件转换成灰度值分析信号强度,代入建立的标准曲线计算得到待测溶液中百草枯的含量

[0154]
4、
实验结果
[0155]
本发明用于检测百草枯的
nhs
磁珠-微流控免疫检测方法对对百草枯的检测限为
0.0028ng/ml
,线性范围为
0.064

1000ng/ml
,标准曲线如图5所示

[0156]
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变

修饰

替代

组合

简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内

当前第1页1  
相关技术
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
网站地图