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文档序号:36405649发布日期:2023-12-16 12:00阅读:15来源:国知局
基因
基因zmmyb86在提高植物抗旱性能中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程技术领域,具体地说,涉及基因
zmmyb86
在提高植物抗旱性能中的应用



背景技术:

2.在全球气候变化的背景下,极端气象事件频发

干旱作为其中最复杂也是最具破坏性的自然现象之一,因其分布广泛

发生频率高

持续时间长的特性,对生态

农业和社会经济都会造成严重影响

研究表明,在全球范围内,未来干旱事件发生的风险将进一步增加

因此需要了解在干旱胁迫来临时,玉米的生理生化指标变化及其分子遗传机制,利用遗传改良技术提高玉米耐旱性,为培育出玉米新种质,进而提高玉米产量奠定基础

3.玉米位居中国粮食作物种植面积及产量之首,播种面积和产量约占粮食作物总面积和总产量的
33%

36%
,在中国粮食生产中的地位举足轻重,因此,研究玉米对土壤水分的响应规律,探明不同生育时段不同程度干旱对玉米生产的影响,对保障粮食安全等意义重大

4.myb
转录因子是植物中最大的一类转录因子家族,
myb
蛋白在抵抗非生物胁迫调控中有重要作用,对玉米
myb
转录因子家族进行功能分类和分析鉴定,可为玉米
myb
转录因子家族蛋白的抗旱功能研究奠定基础,为研究玉米
myb
转录因子家族蛋白应答干旱胁迫提供重要借鉴
。myb
转录因子,在植物中家族成员数量较多,在拟南芥
(arabidopsis thaliana)、
玉米
(zea mays l

) 和水稻
(oryza sativa l

)

myb
类转录因子各有
168、203

130

。myb
转录因子家族成员都具有高度保守的
myb
结构域.通常根据其所包含的
myb
结构域的重复数量将
myb
类转录因子分为
myb-related、r2r3-myb(2r-myb)、3r-myb

4r-myb
四类,
r2r3-myb
类蛋白在其n端含有
dna
结合结构域,c端含有激活或抑制结构域,其参与植物生长发育

代谢

胁迫以及代谢等生理机制的调节

目前
myb
转录因子家族已被证明参加了植物对干旱的应答,大麦转录因子
hvmyb1
是耐旱性的正调控因子,玉米
myb
转录因子
zmmyb3r
的表达可以提高转基因植株的干旱和盐胁迫耐受性,杨树中的
ptrmyb94

aba
信号协同作用,可以提高植物的抗旱性



技术实现要素:

5.本发明的目的是提供基因
zmmyb86
在提高植物抗旱性能中的应用

6.为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供基因
zmmyb86
在提高植物抗旱性能中的应用

7.所述基因
zmmyb86
为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因:(a)由
seq id no:2
所示的氨基酸序列组成的蛋白质;或(b)
seq id no:2
所示序列经取代

缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质

8.本发明所述植物包括但不限于玉米

水稻

小麦

拟南芥

9.第二方面,本发明提供一种提高植物抗旱性能的方法,包括:利用基因工程手段,在植物中过表达基因
zmmyb86
;所述过表达的方式选自以下1)
~5
),或任选的组合:1)通过导入具有所述基因的质粒;2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数;3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列;4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接;5)通过导入增强子

10.进一步地,将基因
zmmyb86
构建到植物表达载体(如
pcambia3301
)上,用重组载体转化植物,筛选阳性转基因植株

11.第三方面,本发明提供基因
zmmyb86
在玉米种质资源改良中的应用

12.第四方面,本发明提供基因
zmmyb86
在制备抗旱转基因玉米中的应用

13.本发明通过克隆
zmmyb86
基因,并进行植物过表达载体的构建,然后通过农杆菌介导法转化到玉米植株中,在干旱胁迫条件下探究其基因功能

为后续抗旱玉米新品系的培育和种质资源创新提供理论依据和技术支撑,在提高玉米植株在非生物胁迫中的耐旱性方面具有广阔前景

附图说明
14.图1为本发明较佳实施例中转基因玉米
bar
基因的检测结果

15.图2为本发明较佳实施例中干旱胁迫处理下转基因玉米与野生型玉米
ros
清除酶酶活性柱状图

16.图3为本发明较佳实施例中干旱胁迫处理下转基因玉米与野生型玉米表型变化结果图

17.图4为本发明较佳实施例中干旱胁迫处理下转基因玉米与野生型玉米气孔变化结果图

18.图5为本发明较佳实施例中正常培养条件和干旱胁迫处理下转基因玉米与野生型玉米叶片
nbt
染色结果图

19.图6为本发明较佳实施例中正常培养条件和干旱胁迫处理下转基因玉米与野生型玉米叶片
dab
染色结果图

具体实施方式
20.本发明提供玉米抗旱基因
zmmyb86
及其应用,以提供一种新的可用于玉米抗旱遗传改良的基因

21.本发明采用如下技术方案:本发明提供一种玉米抗旱基因
zmmyb86
,其核苷酸序列如序列表
seq id no:1
所示

22.本发明还提供上述玉米抗旱基因
zmmyb86
在提高玉米抗旱性能中的应用

23.本发明还提供上述玉米抗旱基因
zmmyb86
在玉米种质资源改良中的应用

24.本发明还提供上述玉米抗旱基因
zmmyb86
在制备抗旱转基因玉米中的应用

25.本发明还提供一种玉米抗旱基因
zmmyb86
的编码蛋白,其氨基酸序列如
seq id no:2
所示

26.本发明还提供含有上述玉米抗旱基因
zmmyb86
的生物材料,所述生物材料为表达盒

载体

工程菌或细胞

27.进一步地,所述生物材料为载体,所述载体为
pcambia3301
载体,所述
pcambia3301
载体的多克隆位点区域依次连接有
35s
启动子

所述
zmmyb86
基因和终止子

28.进一步地,所述生物材料为细胞,所述细胞为宿主细胞,所述宿主细胞含有上述的载体,和
/
或其基因组中整合有外源的
zmmyb86
基因的正向或反向序列

29.本发明还提供一种提高植物抗旱性能的方法,将上述的玉米抗旱相关基因
zmmyb86
整合到植物的细胞

组织和器官中,并使其过量表达

30.进一步地,所述植物包括玉米

水稻

小麦

拟南芥

31.以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围

若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如
sambrook
等分子克隆实验手册(
sambrook j&russell dw
, molecular cloning: a laboratory manual, 2001
),或按照制造厂商说明书建议的条件

32.实施例
1 zmmyb86
基因的克隆
33.选择玉米自交系
h8186
为实验材料,提取三叶期玉米叶片组织,并反转录成
cdna
备用

34.从玉米数据库检索获取
zmmyb86
的生物学信息,转录本
id

nm_001147132.1。
以基因序列为模板设计特异性扩增引物,特异性扩增引物序列如下:
zmmyb86-f
:5’‑ꢀ
gcattgccccgtctcttagt
ꢀ‑3’
zmmyb86-r
:5’‑ꢀ
gtgtgtatcatggcctagacaaaa-3’以
cdna
为模板,
zmmyb86-f

zmmyb86-r
为引物,利用
takara
公司生产的高保真酶
primer star max premix(2
×
)
进行扩增反应,扩增反应体系如表1所示:表135.pcr
扩增程序为:
95℃ 5min
预变性,
95℃ 30s
变性,
58℃ 35s
退火,
72℃ 30s
延伸,共
30
个循环后,加
0.5
μ
l

taq
酶,给
3'
端加上
poly
尾巴,最后,
72℃
下继续延伸
10min
完成反应,获得的
pcr
产物用质量比为
1%
的琼脂糖凝胶电泳检测

36.将目标基因用
axygen
公司的胶回收试剂盒进行切胶回收,与
pmd-18t
载体连接后转化到
dh5
α
大肠杆菌感受态细胞中,筛选阳性克隆子,并送去测序

测序结果表明,克隆获得片段大小为
816bp
(图1)

37.zmmyb86
基因的比对验证:测序结果经
mega6.0
软件与数据库中的序列比对后,与
seq id no:1
所示的核苷酸
46.4、

zmmyb86
基因玉米的筛选
10
天后取
1.5g
左右玉米叶片,提取其基因组并以
bar
基因为目的基因,对筛选的阳性植株进行分子检测,初步鉴定转基因玉米是否转化成功

47.5、

zmmyb86
基因阳性玉米植株后代的获得按照上述步骤的方法,将初步鉴定为转基因玉米植株继续在培养室中培养5个月,获得
t0
代转基因玉米的种子

将初步鉴定为转基因玉米植株的种子(
t0
代)用含除草剂的培养基平板进行筛选,获得
t1
代玉米植株,并将
t1
代玉米植株移栽到营养土,营养黑土和蛙石体积比为
1:1
,继续温室培养以获得
t1
代转基因玉米

48.6、
在干旱胁迫条件下对转基因玉米与野生型玉米的地上表型进行观察与上述
t1
代转基因玉米相同条件
25℃

16h/8h

/
暗下,培养野生型玉米与
t1
代转基因玉米长到三叶期时一组进行干旱
14d
处理,同时对另一组三叶期植株进行
10% peg 6000
溶液下进行为期
4h
干旱模拟处理,进行表型观察与气孔开闭

49.结果如图3所示,在常温条件下培养时,转基因玉米与野生型玉米长势大致相同,在干旱处理
14d
后,出现叶片萎蔫的现象,野生型玉米叶片萎蔫程度大于转基因玉米,实验结果表明
zmmyb86
基因可以使玉米对干旱胁迫耐受性增强

50.7、
在干旱胁迫条件下对转基因玉米与野生型玉米的酶活活性测定野生型玉米
h8186
种子和
t1
代转基因玉米的种子点在播种在营养土中,待玉米生长到三叶期时,采取叶片,分别测定
ros
清除酶酶活活性

每组设置3个重复实验,统计数据

如图2所示,在正常水分培养条件下,转基因玉米和野生型玉米的
ros
清除酶酶活活性没有明显区别;在
10%peg 6000
的干旱模拟胁迫下,转基因玉米和野生型玉米的生长都
ros
清除酶酶活都上调,其中转基因玉米的
ros
清除酶酶活活性较野生型明显增加

实验结果表明
zmmyb86
基因可以增强玉米在干旱胁迫条件下的
ros
清除酶酶活活性

51.8、
在干旱胁迫条件下对转基因玉米与野生型玉米的气孔开闭测定野生型玉米
h8186
种子和
t1
代转基因玉米的种子点在播种在营养土中,待玉米生长到三叶期时,采取叶片,将其放在电竞固定液(
2.5%
戊二醇)中,通过扫描电镜观测气孔开闭

每组设置3个重复实验,统计数据

如图4所示,在正常水分培养条件下,转基因玉米和野生型玉米的气孔皆为张开;在
10%peg 6000
的干旱模拟胁迫下,转基因玉米相对与野生玉米气孔响应干旱更加迅速,在
2h
时对照组的气孔还处于半张开状态,而转基因玉米的气孔已经关闭,有效减少了水分的散失

实验结果表明
zmmyb86
基因可以增强玉米在干旱胁迫条件下的气孔敏感性

52.9、
干旱胁迫处理下转基因玉米与野生型玉米叶片
ros
含量组织化学染色分析组织化学氮蓝四唑
(nbt)
染色法经常用来检测植物组织中o2-的积累,一般颜色越浅,表明该植株的抗氧化能力越强,可以方便快速地表示植物所受到的胁迫,颜色较深则表
明植物组织中活性氧的积累较多

生物体在有氧环境中会产生各种各样的
ros
分子,例如超氧阴离子

过氧化氢

羟基自由基

单线态分子氧及脂质过氧化物等
。ros
活性非常大且极其不稳定,因此
ros
的检测通常因其最终产物而定

其中的过氧化氢可通过
dab
染色来检测,植物根尖或叶片中产生过氧化氢的部位会呈深棕色,其它呈浅棕色或者无色或者呈植物本身的色素

53.将步骤6中干旱处理后的转基因玉米和野生型玉米分别进行组织化学染色

54.nbt
染色:首先配置
nbt
溶液,称取
0.05gnbt

50ml
离心管中,加入
0.5ml1m
磷酸缓冲液(
ph7.8
),加入
ddh2o
定容至
50ml。
然后将取样的叶片置于
nbt
溶液中染色
0.5 h
后取出,将染色后的叶片用
95%
的酒精脱色,直至叶绿素完全降解以便于观察并拍照记录

55.dab
染色:首先配置
dab
溶液,称取
0.02g dab

38ml ddh2o

0.2m hcl

ph
以便溶解,配成终浓度为
0.5mg/ml

dab
染液(注意现用现配,避免自氧化)

然后将取样的叶片置于
dab
溶液中染色
0.5 h
后取出,将染色后的叶片用
95%
的酒精脱色,直至叶绿素完全降解以便于观察并拍照记录

56.如图5所示,
nbt
染色结果显示,在常温条件下培养时转基因玉米和野生型玉米颜色深浅程度没有明显区别;在
10%peg6000
条件下培养
4h
后,转基因玉米和野生型玉米颜色均会加深且野生型玉米颜色会深于转基因玉米

如图6所示,
dab
染色结果显示在常温条件下培养时转基因玉米和野生型玉米颜色深浅程度没有明显区别;在
10%peg6000
条件下培养
4h
后,转基因玉米和野生型玉米颜色均会加深且野生型玉米颜色会深于转基因玉米

实验结果表明,
zmmyb86
能提高玉米叶片的抗氧化能力,进而提高植株对干旱的耐受性

57.通过对转基因植株的耐旱性试验,结果发现在干旱胁迫下,转基因植株抗氧化能力较高,所受胁迫伤害较小,进一步验证了基因与植物的抗旱调控相关,过量表达该基因可以提高转基因植株的耐旱性,从而为玉米品种的基因工程改良提供了新的遗传资源

58.与现有技术相比,本发明首次揭示了基因
zmmyb86
为一种新的植物抗旱相关基因,在干旱胁迫条件下的防御起着至关重要的作用

该基因的研究为后续抗旱玉米新品系的培育和种质资源创新提供理论依据和技术支撑

59.虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的

因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围

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