重组红色红球菌及其在化合物合成中的应用的制作方法-尊龙凯时官方app下载

文档序号:36497182发布日期:2023-12-27 19:21阅读:12来源:国知局
重组红色红球菌及其在化合物合成中的应用的制作方法

1.本技术涉及基因工程和合成生物技术领域,具体涉及一种重组红色红球菌及其在化合物合成中的应用。


背景技术:

2.红色红球菌是一种革兰氏阳性菌,在生物催化、生物降解和生物质利用等方面有重要的应用。
目前含腈水合酶、腈水解酶、酰胺酶、转氨酶、环氧化物水解酶等重要工业酶的红球菌作为生物催化剂,已被广泛应用于酰胺、羧酸、手性医药中间体等重要化合物的工业化生产中。
然而,在制备高浓度目标化学品时,底物或产物浓度过高、反应放热等问题容易导致红球菌细胞破裂,释放色素,导致产物溶液颜色加深,影响产品质量,增加产品后处理成本。
因此,降低红球菌细胞内的色素含量,对于提高红球菌细胞催化产物的产品质量、降低生产成本有重要意义。
3.类胡萝卜素是一类由类异戊二烯聚合物构成的天然色素,广泛存在于动物、植物、真菌、藻类和细菌中,较为常见的是c40
骨架的番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质、虾青素、辣椒红素等四萜类化合物。
多数红球菌可合成较大量的天然类胡萝卜素,故菌落颜色呈现橙黄色或红色。
红球菌在生物催化反应中释放的色素主要为类胡萝卜素,但迄今为止,尚未有通过基因工程改造弱化红球菌色素合成的相关报道。
4.虽然类胡萝卜素生物合成的主要途径已基本明确,但大多数红球菌中类胡萝卜素合成的关键基因尚不清晰,特别是红色红球菌的类胡萝卜素合成相关途径迄今未见报道。
红球菌通常含有冗余基因序列,有时存在多个不同基因编码相同功能的蛋白,但其活性通常存在较大差异,且难以预测具体哪个基因起主要催化作用,这也进一步增加了关键基因鉴定的难度。


技术实现要素:

5.基于此,本技术有必要提供一种降低色素合成的重组红色红球菌,及其在酰胺类、羧酸类等化合物合成中的应用。
6.具体技术方案如下:一种重组红色红球菌,所述重组红色红球菌中的类胡萝卜素合成基因被降低表达或者敲除;降低表达或者敲除的所述类胡萝卜素合成基因包括编码ggpp合成酶的基因crte-1、编码八氢番茄红素脱氢酶的基因crti、编码胡萝卜素合成相关膜蛋白的基因crtm和编码八氢番茄红素合成酶的基因crtb的至少一个。
7.在其中一个实施例中,降低表达或者敲除的所述类胡萝卜素合成基因包括编码ggpp合成酶的基因crte-1和/或编码八氢番茄红素脱氢酶的基因crti。
8.所述的重组红色红球菌在化合物合成中的应用。
9.在其中一个实施例中,所述化合物包括酰胺类化合物、羧酸类化合物、手性环氧化物和手性胺类化合物中的一种或多种。
10.相对于传统技术,本技术具备如下有益效果:本技术分析和鉴定了与红色红球菌的类胡萝卜素合成的关键基因,通过使类胡萝卜素合成的关键基因失活,构建了不同的类胡萝卜素合成弱化的重组红色红球菌,筛选得到不影响红球菌的生长和产酶、同时降低色素含量的重组红色红球菌。
进一步将其用于酰胺类、羧酸类、手性环氧化物和手性胺类等化合物合成,提高化合物的质量。
附图说明
11.图1为红色红球菌的类胡萝卜素合成基因分布;图2为抑制不同的类胡萝卜素合成基因对类胡萝卜素含量的影响;图3为抑制不同的类胡萝卜素合成基因对红球菌生长的影响;图4为抑制不同的类胡萝卜素合成基因对红球菌腈水合酶活性的影响;图5为重组菌th-crte1和th-control
的菌体颜色对比;图6为重组菌th-crte1和th-control
所合成丙烯酰胺水合液的颜色对比。
具体实施方式
12.为使本技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面对本技术的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本技术。
但是本技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本技术内涵的情况下做类似改进,因此本技术不受下面公开的具体实施例的限制。
13.除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本技术。
本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
14.为解决反应过程中红色红球菌的色素释放影响红球菌细胞催化产物的产品质量的问题,本技术首先通过生物信息技术分析了红色红球菌类胡萝卜素合成的关键基因,其包括编码ggpp合成酶的基因crte-1和crte-2、编码八氢番茄红素脱氢酶的基因crti、编码胡萝卜素合成相关膜蛋白的基因crtm、编码八氢番茄红素合成酶的基因crtb、编码番茄红素
β-环化酶crty。
通过基因失活(抑制或敲除)构建不同的色素合成弱化的重组红色红球菌,筛选得到不影响红球菌的生长和产酶、同时降低色素含量的菌株。
将其用于酰胺类、羧酸类、手性环氧化物和手性胺类等化合物合成,提高化合物的品质。
15.本技术一实施方式提供了一种降低色素合成的重组红色红球菌,该重组红色红球菌中的类胡萝卜素合成基因被表达抑制或敲除。
其中,表达抑制或敲除的类胡萝卜素合成基因包括编码ggpp合成酶的基因crte-1、编码八氢番茄红素脱氢酶的基因crti、编码胡萝卜素合成相关膜蛋白的基因crtm、编码八氢番茄红素合成酶的基因crtb的至少一个。
16.在一个具体示例中,表达抑制或敲除的类胡萝卜素合成基因包括编码ggpp合成酶的基因crte-1和/或编码八氢番茄红素脱氢酶的基因crti。
使crte1或crti基因失活可不同程度降低类胡萝卜素的产量,对细菌的生长和产酶没有负面影响。
其中,crte1基因的失活使类胡萝卜素含量降低
95%
以上,生物量(od460
值)提高
11%,腈水合酶发酵酶活提高
6%,该菌株的发酵液用于高浓度丙烯酰胺的合成,所得到的水合液色度显著降低,提高了产品质量。
与crte1基因失活相比,crte1和crti基因同时失活,使腈水合酶酶活提高
21%,类胡萝卜素含量降低
57%。
17.在一个具体示例中,敲除包括敲除类胡萝卜素合成基因的部分或全部。
18.在一个具体示例中,编码ggpp合成酶的基因crte-1的核苷酸序列如seq id no:1所示,和/或编码八氢番茄红素脱氢酶的基因crti的核苷酸序列如seq id no:3所示,和/或编码胡萝卜素合成相关膜蛋白的基因crtm的核苷酸序列如seq id no:4所示,和/或编码八氢番茄红素合成酶的基因crtb的核苷酸序列如seq id no:5所示。
19.在一个具体示例中,敲除类胡萝卜素合成基因构建遗传稳定的重组菌株,该敲除类胡萝卜素合成基因的方法包括同源重组双交换方法。
20.在一个具体示例中,利用所述同源重组双交换方法构建重组红色红球菌的方法包括如下步骤a~b:步骤a,将类胡萝卜素合成基因的上游同源序列和下游同源序列连接到自杀质粒载体中,获得重组自杀质粒载体。
21.根据类胡萝卜素合成基因的上下游序列设计引物以分别扩增类胡萝卜素合成基因的上游同源序列和下游同源序列。
22.步骤b,将所述重组自杀质粒载体导入到红球菌中,筛选获得重组红色红球菌。
23.在一个具体示例中,筛选的方法包括通过含抗生素的平板进行第一轮筛选,获得第一次重组菌,通过含蔗糖的平板对所述第一次重组菌进行第二轮筛选,获得重组红色红球菌。
24.可选地,自杀质粒载体包括pk18mobsacb。
25.在一个具体示例中,降低类胡萝卜素合成基因表达的方法包括crispri技术、反义rna技术、rna干扰以及启动子弱化方法中的一种或多种。
26.crispri 技术通过dcas9-sgrna复合物与目标dna的靶向结合形成空间位阻抑制目标dna的转录,形成对目标基因表达的抑制。dcas9-sgrna复合物能够以两种方式抑制目标dna的转录:(1)通过阻止rna聚合酶结合dna启动子抑制转录起始。
(2)通过空间位阻抑制转录延伸。
27.在一个具体示例中,rna干扰技术中使用的小分子rna包括mirna、sirna、dsrna和shrna。
在一个具体示例中,利用crispri技术构建重组红色红球菌的方法包括将含有dcas9基因的载体和含有靶向类胡萝卜素合成基因的sgrna的载体导入到红球菌中,构建重组红色红球菌。
28.将crispr/cas9蛋白的两个具有核酸内切酶活性的结构域hnh和ruvc分别进行h840a和d10a定点突变,从而得到失去核酸内切酶活性的dcas9蛋白。
29.在一个具体示例中,靶向编码ggpp合成酶的基因crte-1的sgrna的识别序列:ggcgtcctcctggtcgtgtg(seq id no:11中第
5-24位的核苷酸序列);靶向编码八氢番茄红素脱氢酶的基因crti的sgrna的识别序列:cgacggtcgcctcgcgttcg(seq id no:15第
5-24位核苷酸序列);编码胡萝卜素合成相关膜蛋白的基因crtm的sgrna的识别序列: tccgggggacgctgctgttc(seq id no:17中第
5-24位核苷酸序列);
编码八氢番茄红素合成酶的基因crtb的sgrna的识别序列:atagtacgtccggccgtgcg(seq id no:19中第
5-24位核苷酸序列)。
30.本技术一实施方式还提供了所述的重组红色红球菌在化合物合成中的应用。
在一个具体示例中,该化合物包括酰胺类化合物、羧酸类化合物、手性环氧化物和手性胺类化合物中的一种或多种。
31.在一个具体示例中,该重组红色红球菌中包括携带有外源酶编码基因的外源质粒。
通过在重组红色红球菌中引入携带有外源酶编码基因的外源质粒表达外源酶,利用外源酶催化底物合成目标化合物,提高化合物的质量和产量。
32.在一个具体示例中,外源酶包括腈水解酶、腈水合酶、转氨酶和/或环氧化物水解酶中的一种或多种。
33.具体地,可以利用腈水解酶催化合成羧酸类化合物,利用环氧化物水解酶催化合成手性环氧化物,利用转氨酶催化合成手性胺类化合物,利用腈水合酶催化合成酰胺类化合物。
34.在一个具体示例中,酰胺类化合物包括丙烯酰胺和/或烟酰胺。
35.在一个具体示例中,丙烯酰胺或烟酰胺合成的方法包括如下步骤:利用上述重组红色红球菌的基因组表达腈水合酶,和/或通过在重组红色红球菌中引入携带有腈水合酶编码基因的外源质粒表达腈水合酶;利用腈水合酶催化丙烯腈或
3-氰基吡啶水合反应,合成丙烯酰胺或烟酰胺。
36.在一个具体示例中,水合反应的温度为
15℃~45℃。
可选地,水合反应的温度为
18℃~25℃。
37.在一个具体示例中,丙烯酰胺或烟酰胺合成的方法包括步骤(1)~
步骤(3):步骤(1),制备上述重组红色红球菌的种子液。
38.在一个具体示例中,重组红色红球菌还可以携带腈水合酶编码基因的外源质粒。
39.在一个具体示例中,制备上述重组红色红球菌的种子液使用的种子培养基包括葡萄糖
10 g/l
ꢀ‑
50 g/l,酵母膏
1 g/l
ꢀ‑
4 g/l,蛋白胨
1 g/l
ꢀ‑
10 g/l,kh2po40.2 g/l
ꢀ‑
3 g/l,k2hpo40.2 g/l
ꢀ‑
3 g/l,mgso4·
7h2o 0.2 g/l
ꢀ‑
3 g/l
和味精
1 g/l,ph值为
7.0-7.5。
40.步骤(2),利用上述的种子液制备上述重组红色红球菌的发酵液。
41.在一个具体示例中,制备上述重组红色红球菌的发酵液的发酵培养基包括葡萄糖
10 g/l
ꢀ‑
50 g/l,尿素
5 g/l
ꢀ‑
20 g/l,酵母膏
1 g/l
ꢀ‑
4 g/l,蛋白胨
1 g/l
ꢀ‑
10g/l,kh2po40.2 g/l
ꢀ‑
3 g/l,k2hpo40.2 g/l
ꢀ‑
3 g/l,mgso4·
7h2o 0.2 g/l
ꢀ‑
3 g/l,味精
1 g/l
和cocl20.03 mmꢀ‑
0.5 mm,ph值为
7.0-7.5。
42.步骤(3),利用上述发酵液和丙烯腈或
3-氰基吡啶进行水合反应,合成丙烯酰胺或烟酰胺。
43.下面将结合实施例对本技术的实施方案进行详细描述。
应理解,这些实施例仅用于说明本技术而不用于限制本技术的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,优先参考本技术中给出的指引,还可以按照本领域的实验手册或常规条件,还可以按照制造厂商所建议的条件,或者参考本领域已知的实验方法。
44.下述的具体实施例中,涉及原料组分的量度参数,如无特别说明,可能存在称量精度范围内的细微偏差。
涉及温度和时间参数,允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受
的偏差。
45.实施例1注释红色红球菌的类胡萝卜素合成相关基因红色红球菌(cn101663389a)采用
lb培养基培养后,收集菌体,由金唯智生物科技公司进行基因组三代测序,使用rast server (http://rast.nmpdr.org/) 对基因组进行分析注释,对比 kegg、go数据库,确定其产类胡萝卜素代谢通路。
主要相关基因包括2个编码ggpp(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸,geranylgeranyl pyrophosphat)合成酶的基因(分别命名为crte-1和crte-2,dna序列分别如seq id no:1和seqid no:2所示),1个编码八氢番茄红素脱氢酶的基因(命名为crti,dna序列如seq id no:3所示),1个编码胡萝卜素合成相关膜蛋白的基因(命名为crtm,dna序列如seq id no:4所示),1个编码八氢番茄红素合成酶的基因(命名为crtb,dna序列如seq id no:5所示),1个编码番茄红素
β-环化酶(命名为crty,dna序列如seq id no:6所示)。
46.β-胡萝卜素的部分合成途径以及上述基因的分布如图1所示,crte-1、crti、crtm、crtb等4个基因相邻,处于同一基因簇;而crte-2、crty与其他基因的距离较远,分别独立存在。
47.基因注释的分析结果也证实所述的红球菌基因冗余性。
编码ggpp合成酶的基因有两个,具体哪个在类胡萝卜素的合成中起主要催化作用仍然有待分析。
48.实施例2利用crispri技术抑制红色红球菌的类胡萝卜素合成相关基因本实施例在红球菌双质粒crispr基因敲除系统(cn110499274a)的基础上,构建crispri系统用于红色红球菌类胡萝卜素基因的抑制。
49.首先构建pnv-pa2-dcas9,具体如下:pnv-pa2-cas9(cn110499274a)使用xbai和kpni酶切得到质粒骨架;以pnv-pa2-cas9为模板,使用引物d10a-f和h840a-r,引物h840a-f和dcas9-r扩增得到两个基因片段;将基因片段和质粒骨架进行gibson连接得到pnv-pa2-dcas9,即在cas9蛋白中引入d10a和h840a两个突变使其丧失核酸酶活性,但保留dna结合能力。
50.使用http://www.rgenome.net/cas-designer/
网站,设计靶向crte-1、crte-2、crti、crtem、crtb等5个基因的sgrna,合成引物,并构建pbnvcm-sgrna系列的质粒,具体如下:质粒pbnvcm-sgrna使用bbsi酶切得到质粒骨架;将引物crte-1-f和crte-1-r、crte-2-f和crte-2-r、crti-f和crti-r、crtm-f和crtm-r、crtb-f和crtb-r、crty-f和crty-r,分别经
95℃
变性,按
0.1℃/s逐渐降温至
25℃,两个引物互相配对形成带粘性末端的dsdna;将dsdna与质粒骨架使用t4 dna连接酶连接后得到靶向不同基因的质粒pbnvcm-crte1-sgrna、pbnvcm-crte2-sgrna、pbnvcm-crti-sgrna、pbnvcm-crtm-sgrna、pbnvcm-crtb-sgrna、pbnvcm-crty-sgrna。
51.将pbnvcm-crte1-sgrna、pbnvcm-crte2-sgrna、pbnvcm-crti-sgrna、pbnvcm-crtm-sgrna、pbnvcm-crtb-sgrna、pbnvcm-crty-sgrna等质粒分别与pnv-pa2-dcas9同时导入红色红球菌,即得到抑制不同类胡萝卜素合成基因的重组菌株,分别命名为th-crte1、th-crte2、th-crti、th-crtm、th-crtb、th-crty。
将不靶向任何基因的质粒pbnvcm-sgrna和pnv-pa2-dcas9同时导入红色红球菌,即得到对照菌株th-control。
52.本实施例所用引物的序列如表1所示,其中下划线部分为所设计sgrna的识别序列。
53.表1实施例1所用的引物及序列实施例3测定重组红色红球菌的od460
值及类胡萝卜素含量和腈水合酶活性将重组菌th-crte1、th-crte2、th-crti、th-crtm、th-crtb、th-crty和th-control
分别接种至添加
25 μg/ml
卡那霉素和
5 μg/ml
氯霉素的种子培养基(葡萄糖
10-50 g/l,酵母膏
1-4 g/l,蛋白胨
1-10 g/l,kh2po40.2-3 g/l,k2hpo40.2-3 g/l,mgso4·
7h2o 0.2-3 g/l,味精
1 g/l,ph值为
7.5),
25~37℃、100~200 rpm培养
48小时,按照
10%
比例转接至发酵培养基(葡萄糖
10-50 g/l,尿素
5-20 g/l,酵母膏
1-4g/l,蛋白胨
1-10g/l,kh2po40.2-3 g/l,k2hpo40.2-3 g/l,mgso4·
7h2o 0.2-3 g/l,味精
1 g/l,cocl20.03-0.5mm,ph值为
7.5),
28℃、200rpm发酵培养
48小时收获菌液,使用分光光度计测定od460,并测定腈水合酶活性(方法参考cn107177581a)以及类胡萝卜素含量。
类胡萝卜素的测定方法具体如下:取
1ml
发酵液,
10000
×g离心3分钟离心后收集菌体,用蒸馏水悬浮菌体后再离心,用
1ml
丙酮重悬,然后
55℃
闭光加热
15分钟,然后
10000
×g离心
10分钟,使用丙酮作为空白参考,测定上清液在
475nm处的吸光度。
按照以下公式计算类胡萝卜素的产量(mg/l
):c=3.994a454。
54.几种不同重组菌发酵
48小时后的od460、腈水合酶酶活和类胡萝卜素产量分别如图
2、图3和图4所示。
55.抑制crtm,使红球菌的od460
降低
33%,酶活降低
49%,crtm编码膜蛋白基因,降低其表达量可能影响红球菌的生长。
而抑制crte1、crte2、crti和crtb基因,对红球菌的生长和产酶的影响较小;其中抑制crte1对生长和产酶有促进作用,可使od460
提高
11%,使腈水合酶酶活提高
6%。
56.抑制crte2和crty对类胡萝卜素的产量没有明显的影响,而抑制crte1、crti、crtm和crtb可不同程度降低类胡萝卜素的产量,其中抑制crte1效果最显著,使类胡萝卜素的产量降低
97.5%。
可以判断,在红色红球菌的两个编码ggpp合成酶的基因crte1和crte2中,crte1对类胡萝卜素的合成起到主要作用。
57.从细胞生长、产酶和类胡萝卜素降低等方面综合分析,th-crte1均是最佳的重组菌。
对比th-control
和th-crte1,可以看出对照菌颜色为橙黄色,而th-crte1则显白色,如图5所示。
这也是首次报道的白色的“红”球菌。
58.实施例4重组红色红球菌催化丙烯腈水合反应生成丙烯酰胺分别取
400ml
重组菌th-control
和th-crte1的细胞悬液(菌浓度
1.5 gdcw/l
),置于
1l
三口瓶中,冰浴条件下进行水合反应。
边搅拌边滴加丙烯腈,控制反应温度为
18~25℃,当丙烯酰胺浓度达到
50%,停止滴加丙烯腈,继续反应1小时使丙烯腈完全消耗。
反应液
10000
×g离心
20
分钟,分离菌体,得到产物丙烯酰胺溶液。
59.拍照记录丙烯酰胺溶液的颜色,如图6所示,对照菌th-control
的类胡萝卜素含量较高,水合反应过程释放大量色素,导致产物溶液颜色较深;相较之下,重组菌th-crte1合成的产物溶液颜色较浅,产物品质显著提升。
60.实施例5敲除红色红球菌的类胡萝卜素合成相关基因采用crispri技术抑制类胡萝卜素合成相关基因,需要引入外源质粒,一方面增加了红球菌的生理负担;另一方面,质粒存在传代不稳定而丢失的问题。
对于工业生产而言,敲除类胡萝卜素合成相关基因,构建性能稳定的菌种,是必要的。
基于实施例3的结果,类胡萝卜素合成相关基因中,crte-2、crty的抑制对于降低色素含量没有作用,而crtm的抑制会影响红色红球菌的生长,因此本实施例的基因敲除目标是crte-1和crti。
61.采用同源重组双交换方法敲除crte-1和crti,具体如下。
62.构建用于自杀质粒pk18mobsacb-crt:商业化质粒pk18mobsacb由hindiii和xbai酶切得到骨架;以红色红球菌为模板,使用crt-up-f、crt-up-r扩增上游同源臂,使用引物crt-down-f、crt-down-r扩增下游同源臂;三者经gibson连接得到pk18mobsacb-crt。
63.将pk18mobsacb-crt电激转化红色红球菌,复苏培养后涂布至含有
25 μg/ml
卡那霉素
lb平板,通过单交换将其整合至基因组中;单交换菌落进一步涂布到
100 g/l
蔗糖的
lb平板,
28℃
培养3天长出菌落,通过菌落pcr和菌落颜色来区分crte-1和crti基因是否成功敲除,将成功敲除的菌落命名为th‑△crt。
与抑制crte1基因的重组菌th-crte1类似,th‑△crt的菌体显白色,可判断其类胡萝卜素的合成途径被阻断。
64.本实施例所用引物如表2所示。
65.表
2 实施例5所用引物及序列实施例6测定重组菌th‑△crt的生长和腈水合酶酶活将重组菌th‑△crt、th-crte1分别接种至不含抗生素、含
25 μg/ml
卡那霉素和
5 μg/ml
氯霉素的种子培养基(葡萄糖
10-50 g/l,酵母膏
1-4 g/l,蛋白胨
1-10 g/l,kh2po40.2-3 g/l,k2hpo40.2-3 g/l,mgso4·
7h2o 0.2-3 g/l,味精
1 g/l,ph值为
7.5),
25~37℃、100~200 rpm培养
48小时,按照
10%
比例转接至发酵培养基(葡萄糖
10-50 g/l,尿素
5-20 g/l,酵母膏
1-4g/l,蛋白胨
1-10g/l,kh2po40.2-3 g/l,k2hpo40.2-3 g/l,mgso4·
7h2o 0.2-3 g/l,味精
1 g/l,cocl20.03-0.5mm,ph值为
7.5),
28℃、200rpm发酵培养
48小时收获菌液,使用分光光度计测定od460,并测定腈水合酶活性(方法参考cn107177581a)及类胡萝卜素产量。
66.两个重组菌的od460
及腈水合酶活性如表3所示,与th-crte1相比,敲除类胡萝卜素合成基因的重组菌th‑△crt生长几乎没有变化,类胡萝卜素产量进一步降低
57%,而腈水合酶酶活提高了
21%。
其原因在于重组菌th‑△crt不含有外源质粒,可以将更多细胞资源用于腈水合酶的表达。
67.表
3 th-crte1和th‑△crt的od460
及腈水合酶活性对比以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
68.以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。
应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本技术构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本技术的保护范围。
因此,本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准,说明书可以用于解释权利要求的内容。
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