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文档序号:36497187发布日期:2023-12-27 19:23阅读:8来源:国知局
bbd29_11900的制作方法
bbd29_11900基因突变体及其在制备l-谷氨酸中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域,具体涉及bbd29_11900
基因突变体及其在制备
l-谷氨酸中的应用。


背景技术:

2.谷氨酸棒杆菌的谷氨酸生物合成途径由糖开始经糖酵解途径生成丙酮酸,丙酮酸经氧化脱羧径生成乙酰coa,或经过羧化支路生产草酰乙酸,再经过三羧酸循环途径生成
α-酮戊二酸,
α-酮戊二酸经过谷氨酸脱氢酶的催化生产谷氨酸。
3.生产谷氨酸的菌株棒杆菌属和短杆菌属细菌都具有如下的生理特性:
α-酮戊二酸再氧化能力微弱或缺失、谷氨酸脱氢酶活性高、缺乏再nadph氧化能力。
因此,在谷氨酸生产菌中,tca循环到
α-酮戊二酸氧化阶段几乎变成被切断状态,所以可以认为循环没有起到末端氧化体系的作用。
4.葡萄糖酸激酶是将atp末端的磷酸基转移到葡萄糖酸上生成
6-磷酸葡糖酸的酶。
在葡萄糖代谢中间体的生成上发挥重要的作用。
5.因糖代谢在
α-酮戊二酸处被堵塞,导致代谢向谷氨酸方向进行,这显然具有很大意义,它成为谷氨酸发酵得以建立的重要原因。
但这也对丙酮酸等重要的中间产物的产率或产量有直接或间接影响,这些影响仍然影响谷氨酸的生产效率。
6.目前,对于突变的bbd29_11900
基因编码的葡萄糖酸激酶在谷氨酸发酵过程中提高
l-谷氨酸产量方面还未见报道。


技术实现要素:

7.为提高参与谷氨酸棒杆菌合成谷氨酸需要的诸如糖和能量及中间体,本发明将编码葡萄糖酸激酶的基因bbd29_11900
进行定点突变,用于调节谷氨酸棒杆菌优化糖酵解途径蛋白,对谷氨酸棒杆菌的细胞完成必要代谢过程和其它细胞功能,从而更高产谷氨酸。
8.第一方面,本发明要求保护bbd29_11900
蛋白突变体。
9.本发明所要求保护的bbd29_11900
蛋白突变体是将bbd29_11900
蛋白的第
104位氨基酸残基由l替换为p后得到的蛋白质;所述bbd29_11900
蛋白包含(或为)如下任何一:(a1)如seq id no.3所示的蛋白质;(a2)在(a1)所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
10.即所述bbd29_11900
蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
11.第二方面,本发明要求保护编码前文第一方面中所述bbd29_11900
蛋白突变体的核酸分子。
12.进一步地,所述核酸分子可包含(或为)如下任一:(b1)seq id no.2所示的dna分子;(b2)与(b1)限定的dna序列具有
95 %
以上同一性且编码所述bbd29_11900
蛋白突
变体的dna分子。
13.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。
同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。
使用计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关序列之间的同一性。
14.所述
95 %以上同一性具体可为
96 %以上同一性或
97 %以上同一性或
98 %以上同 一性或
99 %以上同一性。
15.第三方面,本发明要求保护含有前文第二方面中所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物(如重组菌)。
16.进一步地,所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
17.进一步地,所述表达盒由启动子、由所述启动子启动表达的所述核酸分子,以及转录终止序列组成;所述启动子以功能性方式与所述核酸分子连接,且所述核酸分子与所述转录终止序列连接。
更进一步地,所述表达盒还可包括增强子。
18.进一步地,所述重组微生物(如重组菌)为含有所述表达盒或所述重组载体的重组微生物(如重组菌)。
19.所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
其中,细菌可为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、北京棒杆菌(corynebacterium pekinense)、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌或泛菌(pantoea)。
进一步地,所述细菌为谷氨酸棒杆菌。
更进一步地,所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgmcc no.21220
或野生型谷氨酸棒杆菌菌株atcc13869。
20.进一步地,所述重组菌为重组细菌,如重组谷氨酸棒杆菌。
21.更进一步地,所述重组菌为将谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码所述bbd29_11900
蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子后得到的重组菌。
22.其中,编码所述bbd29_11900
蛋白的核酸分子可包含(或为)如下任一:(c1)seq id no.4所示的dna分子;(c2)与(c1)限定的dna序列具有
95 %
以上同一性且编码所述bbd29_11900
蛋白的dna分子。
23.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。
同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。
使用计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关序列之间的同一性。
24.所述
95 %以上同一性具体可为
96 %以上同一性或
97 %以上同一性或
98 %以上同 一性或
99 %以上同一性。
25.具体地,将所述谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码所述bbd29_11900
蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子具体可通过即将所述谷氨酸棒杆菌的基因组中seq id no.4的第
311位由t突变为c(其他核苷酸序列不变)实现。
26.在本发明的具体实施方式中,将所述谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码所述bbd29_11900
蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子是通过向所述谷氨酸棒杆菌中导入实施例中的重组载体pk18-bbd29_11900t311c实现的。
27.第四方面,本发明要求保护如下任一应用:p1、前文第一方面中所述的bbd29_11900
蛋白突变体或前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒或重组载体或重组微生物在生产
l-氨基酸(如
l-谷氨酸)中的应用;p2、前文第一方面中所述的bbd29_11900
蛋白突变体或前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒或重组载体在提高细菌(如谷氨酸棒杆菌)的
l-氨基酸(如
l-谷氨酸)产量中的应用;p3、前文第一方面中所述的bbd29_11900
蛋白突变体或前文第二方面中所述的核酸分子或前文第三方面中所述的表达盒或重组载体在构建产
l-氨基酸(如
l-谷氨酸)工程菌株中的应用。
28.第五方面,本发明要求保护一种提高细菌(如谷氨酸棒杆菌)的
l-氨基酸(如
l-谷氨酸)产量的方法。
29.本发明要求保护的提高细菌(如谷氨酸棒杆菌)的
l-氨基酸(如
l-谷氨酸)产量的方法,可包括如下步骤:将细菌(如谷氨酸棒杆菌)的基因组中的编码所述bbd29_11900
蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子,实现细菌(如谷氨酸棒杆菌)的
l-氨基酸(如
l-谷氨酸)产量的提高。
30.第六方面,本发明要求保护一种构建产
l-氨基酸(如
l-谷氨酸)工程菌株的方法。
31.本发明要求保护的构建产
l-氨基酸(如
l-谷氨酸)工程菌株的方法,可包括如下步骤:将细菌(如谷氨酸棒杆菌)的基因组中的编码所述bbd29_11900
蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子,得到所述产
l-氨基酸(如
l-谷氨酸)工程菌株。
32.在第五方面和第六方面中,编码所述bbd29_11900
蛋白的核酸分子可包含(或为)如下任一:(c1)seq id no.4所示的dna分子;(c2)与(c1)限定的dna序列具有
95 %
以上同一性且编码所述bbd29_11900
蛋白的dna分子。
33.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。
同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。
使用计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关序列之间的同一性。
34.所述
95 %以上同一性具体可为
96 %以上同一性或
97 %以上同一性或
98 %以上同 一性或
99 %以上同一性。
35.具体地,将所述细菌(如谷氨酸棒杆菌)的基因组中的编码所述bbd29_11900
蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子具体可通过即将所述细菌(如谷氨酸棒杆菌)的基因组中seq id no.4的第
311位由t突变为c(其他核苷酸序列不变)实现。
36.在本发明的具体实施方式中,将所述谷氨酸棒杆菌的基因组中的编码所述bbd29_11900
蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子是通过向所述谷氨酸棒杆菌中导入实施例中的重组载体pk18-bbd29_11900t311c实现的。
37.进一步地,在所述方法中,将所述细菌(如谷氨酸棒杆菌)基因组中的编码所述bbd29_11900
蛋白的核酸分子替换为前文第二方面中所述核酸分子后还包括对所得重组细菌(如谷氨酸棒杆菌)进行发酵培养的步骤。
从发酵培养产物中可以获得
l-氨基酸(如
l-谷氨酸)。
38.在进行所述发酵培养的过程中,可以调节培养物的ph(如控制ph为
6.8-7.0
)。
在培养中,培养物的温度可以是
30

40 ℃。
在进行所述发酵培养的过程中,可以控制流加糖浓度(如控制为
50-55 %,即
100 ml
液体中含糖的质量是
50-55 g),控制发酵体系残糖(如控制为
0.5-1.0 %,即
100 ml
液体中含糖的质量是
0.5-1.0 g)。
39.在本发明的具体实施方式中,进行所述发酵培养时采用的培养基的配方见表2,余量为水。
进行所述发酵培养时,发酵控制工艺见表
3。
40.在本发明的具体实施方式中,所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgmcc no.21220
或野生型谷氨酸棒杆菌菌株atcc13869。
41.相应地,前文第三方面中所要求保护的重组菌具体为重组菌ypg-11900
或重组菌g11900。
42.所述重组菌ypg-11900
与所述谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgmcc no.21220
的区别仅在于:所述重组菌ypg-11900
为将谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgmcc no.21220
基因组中bbd29_11900
基因(seq id no.4)替换为突变后bbd29_11900
基因序列(seq id no.2)(具体可通过将seq id no.4的第
311位由t突变为c实现),并保持其他序列不变得到的菌株。
43.所述重组菌g11900
与所述野生型谷氨酸棒杆菌菌株atcc13869的区别在于:所述重组菌g11900
为将所述野生型谷氨酸棒杆菌菌株atcc13869基因组中bbd29_11900
基因(seq id no.4)替换为突变后bbd29_11900
基因序列(seq id no.2)(具体可通过将seq id no.4的第
311位由t突变为c实现),并保持其他序列不变得到的菌株。
44.在上述各方面中,所述
l-氨基酸为
l-谷氨酸。
45.本发明的bbd29_11900
蛋白突变体可以用于生产多种产物,包括但不限于实施例中的谷氨酸,所生产的产物还可为赖氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸,瓜氨酸等。
各种产物的生产时,将本发明bbd29_11900
蛋白突变体的编码基因置于目的产物合成途径中,并对合成途径中的基因进行表达,即可实现目的产物的生产。
46.实验证明:本发明在谷氨酸棒杆菌中将bbd29_11900
基因编码区进行点突变bbd29_11900t311c(即将seq id no.4所示的bbd29_11900
基因编码区野生型序列替换为seq id no.2所示的突变序列),可以显著提高
l-谷氨酸产量(p《0.01)。
本发明对提高
l-谷氨酸产量具有重要意义。
具体实施方式
47.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
48.下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
49.下述实施例中的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgmcc no.21220,
菌株号为ypglu001,已于
2020

11月
23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为cgmcc no.21220。
下文简称谷氨酸棒杆菌cgmcc no.21220。
保藏人宁夏伊品生物科技股份有限公司已经授权内蒙古伊品生物科技有限公司使用该菌株。
50.下述实施例中的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13869为atcc中编号为
13869的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)。
下文简称谷氨酸棒杆菌atcc13869。
51.实施例
1、构建包含点突变的bbd29_11900
基因编码区片段的重组载体依据ncbi公布的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13869基因组序列,设计并合成两对扩增bbd29_11900
基因编码区及其上下游序列的引物,以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgmcc no.21220
(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的bbd29_11900
基因)及野生型谷氨酸棒杆菌菌株atcc13869的bbd29_11900
基因编码区中引入点突变,所述点突变为将bbd29_11900
基因编码区的野生型核苷酸序列(seq id no.4)的第
311位胸腺嘧啶t突变为胞嘧啶c,其他序列不变,得到seq id no.2所示的bbd29_11900
基因突变序列。seq id no.4编码seq id no.3所示的bbd29_11900
野生蛋白;上述点突变导致bbd29_11900
野生蛋白的第
104位的亮氨酸(l)突变为脯氨酸(p),即得到seq id no.1所示bbd29_11900
突变蛋白。seq id no.2编码seq id no.1所示的bbd29_11900
突变蛋白。
52.采用nebuilder重组技术进行载体构建,引物设计如下(上海invitrogen公司合成),加粗字体的碱基为突变位置:p1:
5'-cagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagggacctgtggttggaactctc-3',p2:
5'-gatcgtagtcgccgtgggggtggacgaagacggttcctgg-3',p3:
5'-ccaggaaccgtcttcgtccacccccacggcgactacgatc-3',p4:
5'-cagctatgaccatgattacgaattcgagctcggtacccggacagggtggaggattgg-3'。
53.注:p1和p4上下划线部分是pk18mobsacb载体上自带的序列。
54.具体操作如下:以谷氨酸棒杆菌atcc13869为模板,分别以引物对p1/p2和引物对p3/p4进行pcr扩增,获得两条分别带有突变碱基,大小分别为
823 bp和
819bp的bbd29_11900
基因编码区及其上/下游的dna片段,分别命名为bbd29_11900 up(引物对p1/p2的扩增产物)和bbd29_11900 down(引物对p3/p4的扩增产物)。
55.pcr扩增体系为:
10×ex taq buffer 5 μ
l,dntp mixture(各
2.5 mm)
4 μ
l,mg2

25 mm)
4 μ
l,引物(
10 pm)各
2 μ
l,ex taq(
5 u/
μl)
0.25 μ
l,总体积
50 μl;pcr扩增反应程序为:
94 ℃
预变性
5 min;(
94 ℃
变性
30 s;
52 ℃
退火
30 s;
72 ℃
延伸
40 s)
30
个循环;
72 ℃
过度延伸
10 min。
56.将上述两条dna片段(bbd29_11900 up和bbd29_11900 down)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,与经过酶切(xba i/bamhi)后纯化的pk18mobsacb质粒(biovector ntcc典型培养物保藏中心,质粒上含有卡那霉素抗性标记)用nebuilder酶(neb公司)
50 ℃
连接
30 min,连接产物转化dh5a后长出的单克隆经m13引物(m13f:5’‑tgtaaaacgacggccagt-3’;m13r:5’‑caggaaacagctatgacc-3’)pcr鉴定获得阳性重组载体,命名为pk18-bbd29_11900t311c。
57.将酶切正确的重组质粒pk18-bbd29_11900t311c送测序公司测序鉴定,并将含有正
确点突变(g-a)的重组载体pk18-bbd29_11900t311c 保存备用。
58.重组载体pk18-bbd29_11900t311c的结构描述:将pk18mobsacb质粒的酶切位点xba i/bamhi之间的小片段替换为seq id no.5的第
37-1564位所示的dna片段,保持pk18mobsacb载体的其他序列不变,得到的重组载体。
59.重组载体pk18-bbd29_11900t311c中含有完整的seq id no.5。seq id no.5的第
1-36位和第
1565-1602位为pk18mobsacb质粒上自身序列;第
37-495位为谷氨酸棒杆菌基因组上bbd29_11900
基因编码区上游序列;第
496-999位为bbd29_11900
基因编码区序列,第
1000-1564位为bbd29_11900
基因编码区下游序列。
其中,seq id no.5的第
806位为突变位点,该突变位点使得谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgmcc no.21220
及野生型谷氨酸棒杆菌菌株atcc13869中bbd29_11900
基因编码区的第
311位的胸腺嘧啶(t)突变为胞嘧啶(c)(对应seq id no.2和seq id no.4的第
311位)。
60.实施例
2、构建包含基因bbd29_11900 t311c的工程菌株构建方法:将实施例1构建得到的等位替换质粒(pk18-bbd29_11900t311c)通过电击分别转化入谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgmcc no.21220
及野生型谷氨酸棒杆菌菌株atcc13869中后,在培养基中进行培养,培养基成分和培养条件参见表1,对培养产生的单菌落分别通过实施例1中的引物p1和通用引物m13r(5’‑caggaaacagctatgacc-3’)进行鉴定,能扩增出
1609bp(序列如seq id no.6所示)大小条带的菌株为阳性菌株。
将阳性菌株在含
15%
蔗糖的培养基上培养,对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养,各选择在不含卡那霉素的培养基上生长,而在含卡那霉素的培养基上不生长的十六株菌株(即与基因组发生同源重组阳性的菌株)进一步采用p1和p4引物(序列参见实施例1)扩增后,将pcr产物进行测序,通过序列比对,均获得bbd29_11900
基因编码区的第
311位碱基序列发生突变(t-c)(对应seq id no.2和seq id no.4的第
311位)的菌株,即为等位替换成功的阳性菌株,分别命名为ypg-11900、g11900。
61.重组菌ypg-11900
和g11900
含有seq id no.5的第
37-1564位所示的包括bbd29_11900t311c突变基因的片段。
62.重组菌ypg-11900
与谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgmcc no.21220
的区别仅在于:ypg-11900
为将谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cgmcc no.21220
的bbd29_11900
基因编码区的野生型序列(seq id no.4)替换为突变序列(即seq id no.2),并保持其他序列不变得到的菌株。
63.重组菌g11900
与野生型谷氨酸棒杆菌atcc13869的区别在于:g11900
为将atcc13869的bbd29_11900
基因编码区的野生型序列(seq id no.4)替换为突变序列(即seq id no.2),并保持其他序列不变得到的菌株。
[0064][0065]实施例
3、l-谷氨酸发酵实验将上述实施例2构建的重组菌株ypg-11900、g11900,以及对应的原始菌株谷氨酸棒杆菌cgmcc no.21220
和atcc13869在blbio-5gc-4-h型号的发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以表2所示的培养基和表3所示的控制工艺进行发酵实验。
发酵结束采用sba生物传感仪器(sba-40e)检测
l-谷氨酸产量与od(562nm)。
每个菌株重复三次,结果如表4和表5所示。
[0066]如表4和表5所示,在谷氨酸棒杆菌中将bbd29_11900
基因编码区进行点突变bbd29_11900t311c(即将seq id no.4所示的bbd29_11900
基因编码区野生型序列替换为seq id no.2所示的突变序列),可以显著提高
l-谷氨酸产量(p《0.01)。
[0067][0068][0069][0070][0071]上述实施例
l-谷氨酸产量数据采用单因素方差分析,实验结果p《0.05(*)表示具有显著性差异,p《0.01(**)表示具有极显著性差异。
[0072]以上对本发明进行了详述。
对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。
虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。
总之,按本发明的原理,本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本技术中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。
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