一种基于无溶剂条件下-尊龙凯时官方app下载

文档序号:36497250发布日期:2023-12-27 19:33阅读:4来源:国知局
一种基于无溶剂条件下
一种基于无溶剂条件下ptsa催化的绿色多孔有机聚合物的制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种基于无溶剂条件下ptsa催化的绿色多孔有机聚合物的制备方法和应用。


背景技术:

2.细菌感染在全球范围内严重威胁着人类健康。
每年死于细菌感染的人数占所有死亡人数的
25%,其中滥用抗生素导致的耐药性细菌是主要原因之一。
近年来,抗生素耐药性的迅速获得、耐药细菌感染的不断恶化和感染伤口的缓慢愈合导致在开发同时具备消灭致病菌和加快伤口愈合的新型抗菌材料存在着巨大困难。
因此,人们迫切需要一些替代性的抗菌策略来减轻成本、提高疗效并减少耐药性。
3.近年来,已经开发了一些不使用抗生素的抗菌疗法,例如银离子的受控释放、光热疗法(ptt)、化学动力疗法(cdt)、和光动力疗法(pdt)。
光疗抗菌是一种风险较低的非侵入性替代治疗策略,用于治疗微生物感染。
光疗抗菌疗法主要包括光热疗法(ptt)和光动力疗法(pdt)。
光热疗法利用光敏剂将光能转换为热能,从而杀死细菌。
光动力疗法则利用光敏剂将光能转移到周围的氧气中,产生高活性的单线态氧,从而杀死细菌。
其中,cdt是一种不需要额外能量输入的治疗方法,因此,它可以避免组织中光穿透的限制。
在过去的十年中,许多无机纳米材料,如金属氧化物和金属硫属化物,已经被开发为通过cdt抗菌的纳米剂,因为它们可以催化芬顿或芬顿-如与过氧化氢反应产生高毒性的羟基自由基(
·oh),破坏细菌中的生物分子(如dna和蛋白质)。
4.目前,研究人员已经发现了多种具有光疗效果的光敏剂。
现有的光敏剂存在一些缺点,如激发波长不在最佳透光区域,以及光毒性较大等问题。
二茂铁是一种具有芳香族性质的有机过渡金属化合物,具有高度热稳定性,其衍生物繁多,有些已逐渐用于作为光敏剂。
如申请号为cn202310698629.7的专利公开了一种具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂及其应用,将二茂铁二甲醛、反式肉桂醛、甘露醇加入至有机溶剂中进行溶剂热反应制备得到光敏剂,可实现光热、酶的协同杀菌;但此光敏剂需要在溶剂中聚合得到的。
因此,需要更简单的方法来开发更多的光敏剂,采用单一原料,在无溶剂的条件下制备得到光敏剂,以提高光疗抗菌的效果,并为公共卫生系统带来更大的帮助和挑战。


技术实现要素:

5.针对上述现有技术,本发明的目的是提供一种基于无溶剂条件下ptsa催化的绿色多孔有机聚合物的制备方法和应用。
本发明以含两个及以上乙酰基的芳香族化合物为结构单元,以对甲苯磺酸

水合物为催化剂,在无溶剂环境中制备得到多孔有机聚合物(wfmc-1),该材料可通过ptt和酶协同抗菌,且生物相容性好,无毒副作用。
6.为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:本发明的第一方面,提供一种基于无溶剂条件下ptsa催化的绿色多孔有机聚合物
的制备方法,所述制备方法为:将含两个及以上乙酰基的芳香族化合物、对甲苯磺酸

水合物混合,加热反应,反应结束后得到黑色固体,洗涤、干燥后得到基于无溶剂条件下ptsa催化的绿色多孔有机聚合物。
7.优选的,所述含两个及以上乙酰基的芳香族化合物、对甲苯磺酸

水合物的摩尔比为3:(
0.6~0.9)。
8.优选的,所述含两个及以上乙酰基的芳香族化合物为1,1’‑
二乙酰基二茂铁、4,4’‑
二乙酰基联苯、2,
7-二乙酰芴、1,1',1''-(次氮基三(苯-4,1-二基))三乙酮或
1,3,5-三(4,4',4"-乙酰苯基)苯。
9.优选的,所述洗涤为依次用饱和碳酸氢钠、二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺和水,洗至洗出液无色。
10.优选的,所述干燥为室温下干燥
24h。
11.本发明的第二方面,提供上述制备方法得到的基于无溶剂条件下ptsa催化的绿色多孔有机聚合物。
12.所述基于无溶剂条件下ptsa催化的绿色多孔有机聚合物对细胞的溶血率低于
2%。
13.本发明的第三方面,提供基于无溶剂条件下ptsa催化的绿色多孔有机聚合物在制备抗菌药物中的用途。
14.所述抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的药物。
15.所述抗菌通过光热疗法(ptt)和酶疗法(类芬顿)协同抗菌实现。
16.本发明的有益效果:(1)本发明制备基于无溶剂条件下ptsa催化的绿色多孔有机聚合物wfmc-1的方法简单,无需溶剂,原料单一,降低了制备成本。
17.(2)本发明制备的wfmc-1通过
638nm波长的激光照射产生较好的光热转换效果,也可以催化过氧化氢,产生氧基自由基,从而达到过光热疗法(ptt)和酶疗法协同抗菌的效果。
18.(3)本发明制备的wfmc-1生物相容性高,对h9c2大鼠心肌细胞的细胞活力影响小,对血细胞的溶解率低于
2%,可促进伤口愈合,这有利于其生物领域的应用。
附图说明
19.图1:wfmc-1的红外等谱图,其中(a)wfmc-1~ wfmc-5的红外光谱图;(b)wfmc-1拉曼光谱;(c)
77 k时wfmc-1的低温n2吸收等温线;(d)wfmc-1的孔径分布曲线;(e)wfmc-1的热重曲线;(f)wfmc-1的x射线衍射图谱;图2:wfmc-1的tem和hr-tem,其中(a)1µm比例尺下wfmc-1的tem;(b)
0.5μm比例尺下wfmc-1的tem;(c)
100nm比例尺下wfmc-1的tem;(d)
50nm比例尺下wfmc-1的tem;(e)
10 nm比例尺下wfmc-1的hr-tem;(f)
10nm比例尺下wfmc-1的hr-tem;图3:wfmc-1的元素分布图和edx图,其中(a)wfmc-1的元素分布图;(b)c元素在wfmc-1中的分布情况;(c)fe元素在wfmc-1中的分布情况;(d)wfmc-1的edx图;图4:wfmc-1的光热效应,其中(a)在
1.2 w/cm2的
638 nm激光照射下,wfmc-1的浓度依赖性光热效应;(b)wfmc-1的浓度与升温变化的关系图;(c)wfmc-1 (0~500 μg/ml)在
10min内升温过程的热成像图片;(d)分别在
0.5、0.8、1.0、1.2和
1.5w/cm2的
638nm激光照射1具有良好生物相容性和光疗性能。wfmc-1可以通过光热转换实现局部升温,以达到使细菌膜破裂的效果。
此外,wfmc-1经过激光照射后,会使周围环境中的氧元素转化为对细菌有害的单线态氧,从而使细菌裂解。wfmc-1在最佳抗菌浓度下,几乎没有溶血作用,也几乎不影响正常细胞的生长,使其具有良好的生物应用前景。
23.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
24.说明:
1,1'-二乙酰基二茂铁、1,1',1''-(次氮基三(苯-4,1-二基))三乙酮均购自上海毕得医药科技股份有限公司;
4,4’‑
二乙酰基联苯、1,3,5-三(4,4',4"-乙酰苯基)苯均购自上海鸿皓生物医药科技有限公司;2,
7-二乙酰芴购上海阿拉丁生化科技股份有限公司;对甲苯磺酸

水合物(ptsa)购自上安徽泽生科技有限公司;如无特别标示,本技术所用pbs的ph值为
7.4,h2o2的质量浓度为
30%。
25.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料,均可通过商业渠道购买得到。
26.实施例
1wfmc-1的制备:将称量好的1,1,-二乙酰基二茂铁(810mg,
3mm)、对甲苯磺酸

水合物(
114.13mg,
0.6mm)加入到带有磁子的
15ml
圆底烧瓶中。
将反应体系充分混合。
之后将反应体系在
139℃
下反应
48h。
反应结束后得到一种黑色的聚合物,将反应体系冷却到室温,随后用饱和碳酸氢钠、二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺、水洗至洗出液无色,室温干燥
24h,得到wfmc-1。
本实施例的合成路线见图
14。
27.实施例
2wfmc-2的制备:将称量好的
4,4’‑
二乙酰基联苯(
710mg,3mmol
)、对甲苯磺酸

水合物(
114.13mg,0.6mmol
)加入到带有磁子的
15ml
圆底烧瓶中。
将反应体系充分混合。
之后将反应体系在
130℃
下反应
48h。
反应结束后得到一种黑色的聚合物,将反应体系冷却到室温,随后用饱和碳酸氢钠、二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺、水洗至洗出液无色,室温干燥
24h,得到wfmc-2。
28.实施例
3wfmc-3的制备:将称量好的2,
7-二乙酰芴(
750.9mg,3mmol
)、对甲苯磺酸

水合物(
114.13mg,0.6mmol
)加入到带有磁子的
15ml
圆底烧瓶中。
将反应体系充分混合。
之后将反应体系在
148℃
下反应
48h。
反应结束后得到一种黑色的聚合物,将反应体系冷却到室温,随后用饱和碳酸氢钠、二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺、水洗至洗出液无色,室温干燥
24h,得到wfmc-3。
29.实施例
4wfmc-4的制备:将称量好的
1,1',1''-(次氮基三(苯-4,1-二基))三乙酮(
1114.29mg,3mmol
)、对甲苯磺酸

水合物(
171.20mg,0.9mmol
)加入到带有磁子得
15ml
圆底烧瓶中。
将反应体系充分混合。
之后将反应体系在
135℃
下反应
48h。
反应结束后得到一种黑色的聚合物,将反应体系冷却到室温,随后用饱和碳酸氢钠、二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰
胺、水洗至洗出液无色,室温干燥
24h,得到wfmc-4。
30.实施例
5wfmc-5的制备:将称量好的
1,3,5-三(4,4',4"-乙酰苯基)苯(
1297.53mg,
3mmol
)、对甲苯磺酸

水合物(
171.20mg,0.9mmol
)加入到带有磁子的
15ml
圆底烧瓶中。
将反应体系充分混合。
之后将反应体系在
144℃
下反应
48h。
反应结束后得到一种黑色的聚合物,将反应体系冷却到室温,随后用饱和碳酸氢钠、二氯甲烷、n,n-二甲基甲酰胺、水洗至洗出液无色,室温干燥
24h,得到wfmc-5。
31.表征:(1)催化剂红外光谱的测定:利用红外光谱确定催化剂的结构,分别取
3 mg的wfmc-1、1,1,-二乙酰基二茂铁与干燥溴化钾粉末在研钵中充分研磨并时刻保持干燥,然后放置压片模具中压制成透明无裂痕的模片,将压片放置于红外光谱扫描仪中在
500-400cm-2范围内扫描
36圈。
32.通过傅里叶变换红外光谱(ft-ir)用于验证wfmc-1的构建情况。
如图1(a)所示,正如所见,成的wfmc-1~ wfmc-5的ftir整合了结构单元的特征振动,其中,归属于反应单体的乙酰基在
1750 cm-1处的特征振动消失,而归属于苯的特征振动峰(
1650~1430 cm-1)出现在所有这些多孔有机聚合物的ftir中。
这些结果表明,成功构建了苯连接的多孔有机聚合物。
33.(2)图1(b)显示了wfmc-1的拉曼光谱,其中可以清楚地观察到分别归因于sp2碳的g带和无序碳的d带的
1580

1350 cm-1附近的两个不同峰。
计算出wfmc-1的id/ig的峰面积比为
0.94,表明形成了大的芳族结构。
34.(3)通过n2吸附解吸曲线和孔径分布曲线了解wfmc-1的孔隙分布情况。
如图1(c)-图1(d)所示,wfmc-1的低温n2吸附/解吸等温线显示了典型的以中孔主导的孔隙结构。
计算出的wfmc-1的表面积被确定为
5.7 m2g-1,总孔隙体积为
0.039 cm3g-1。
通过非局部密度函数理论(nldft)实现的wfmc-1相应的孔径分布(psd)进一步揭示了其为典型的ⅰ型等温线,宽的中孔分布在
2-10nm之间。
35.(4)通过热重分析了解wfmc-1的热稳定性。
如图1(e)所示,正如所见,wfmc-1表现出高度的热稳定性,其在
600℃
下的重量保持在其初始重量的
60%
以上。
36.(5)通过 x射线衍射图谱了解wfmc-1的结晶形态,如图1(f)所示。
37.(6)透射电镜tem:将超声分散后的wfmc-1甲醇分散液滴加到铜网上,阴干后得到观察样本,将样本装至tem中观察样本形貌并拍照,导出样本元素分析图及各种元素的原子含量表。
38.透射电子显微镜(tem)对 wfmc-1 的表面形态信息进行了深入研究(图 2)。
根据图
2 (a)
~
(b) 所示的 tem 观察结果,合成的 wfmc-1 由不规则颗粒组成。
从图2(c)
~
(d) 中可以清楚地观察到类似石榴籽的黑色纳米颗粒,它们分散在聚合物基体中。
为了进一步探究纳米级颗粒的组成,采用了高分辨率透射电子显微镜(hr-tem)。
如图 2(e)
~
(f)所示,可以清晰地观察到对应于 fe2o3(3 1 1) 平面的明显晶格边缘,其 d 间距为 0.244nm。
同时,wfmc-1 的元素能量色散光谱(eds)分析(图3)也显示出突出的 c 和 fe 峰,原子百分比分别为 89.49% 和 10.51%,进一步表明 1,
1'-二乙酰基二茂铁聚合成功。
39.(7)wfmc-1的光热性能:通过改变wfmc-1的浓度(
100、200、300、400

500
μg/ml
)或激光的功率密度(
0.5、0.8、1.0、1.2和
1.5w/cm2),对wfmc-1的光热转化性能进行了细致的
研究。
其中,不同浓度wfmc-1的配置方法为:首先称取
10mg的wfmc-1利用超声仪充分分散于
1 ml
蒸馏水中配置为
10mg/ml
的母液,再分别从母液中吸取
10、20、30、40

50
μl于
990、980、970、960

950
μl的蒸馏水中,最终配置为
100、200、300、400

500
μg/ml
的wfmc-1水分散液。
40.首先,在激光照射下(
λ
=638nm,
1.2w/cm2,
10min),对不同浓度的wfmc-1的升温行为进行了研究。
如图4(a)
~
(b)所示,wfmc-1呈现出浓度依赖性的光热转换能力,其温度随着wfmc-1浓度的增加而明显增加。
例如,wfmc-1在
10μg/ml
的浓度下,温度上升最低(
δt)为
13.1℃。
随着浓度的增加,溶液的
δt明显增加,在
500
μg/ml
时达到了
27.2℃
的最大值。
此外,从热成像仪获得的温度图片也可以直观地反映出浓度依赖性的升温行为,见图4(c)。
图4(d)显示了wfmc-1(
500
μg/ml
)在不同激光功率下(
λ
=638nm,
10min)的温度上升情况。
可以看出,随着激光功率密度的增加,wfmc-1的光热性能明显增强,其温度从
37.2℃
迅速上升到
45.2℃、53.9℃、59.3℃、64.3℃

71.4℃,功率的变化范围分别为
0.5w/cm2、0.8w/cm2、1.0w/cm2、1.2w/cm2、1.5w/cm2。
之后,图5(a)显示了通过五个连续的激光开/关循环来估计wfmc-1的光热稳定性。
可以清楚地看到wfmc-1呈现出高效的光热反应,在重复五次开/关循环后几乎没有温度波动,这对实际应用是相当重要的。
41.此外,根据光热转换效率公式1来计算wfmc-1的光热转换效率: η (%) = [hs (tmax–ꢀtsurr)ꢀ–ꢀqdis]/ i (1ꢀ–ꢀ
10–a 638)(公式1);公式中每个元素的含义是: "h "
是传热系数;s是容器的表面积;
"tmax"
是照射
10分钟后的平衡温度(
64.5℃
);
"tsurr"
是实验时的环境温度(
37.1℃
);
"qdis"
是测试单元的散热量(
25.03 mw);
"i"
代表
638纳米的激光功率(
1.2 w/cm2)。"a638 "
是wfmc-1水溶液在
638纳米处的吸光度(
1.34)。
[0042]根据公式2计算hs值: hs = mh2och2o/
τs(公式2); 公式中每个元素的含义是: "mh2o"
是实验时溶剂水的质量(1×
10-3kg);
"ch2o"
是水的比热容(
4.2×
103j/kg℃)。
[0043]根据公式3计算
τs值:t=
ꢀ‑
τs (inθ)(公式3); τs是wfmc-1时间常数(
189.14);
"
θ
"

δt和tmax的比率。
图5(b)
~
(c)显示了公式中
τs与
θ
值。
[0044]综上所述,wfmc-1的光热转换效率(
η
)确定为
50.26%。
最后,图5(d)显示了wfmc-1 分散液在水中培养 30 天前后的温度升高曲线,可清楚的观察到
30 天后记录的升温曲线与初始曲线几乎重合,这表明 wfmc-1 具有超强的稳定性。
[0045](8)wfmc-1的过氧化物酶活性:对wfmc-1在不同ph下过氧化物酶活性进行研究。
[0046]首先,使用双底物系统评估wfmc-1的ros产生能力,即h2o2和3,3’,5,5’‑
四甲基联苯胺(tmb)的显色体系,其中tmb为显色剂。tmb 可被 ros 氧化,形成致色性 oxtmb。
铁的存在赋予了 wfmc-1 在酸性介质中作为高效
·oh 生成器的能力。
评估试验所用tmb的制备方法为:称取tmb(
3.606mg,
0.015mmol
)溶解于
10ml
乙醇中,配置成
1.5mmol/l
的tmb乙醇溶液;所用h2o2的质量浓度为
30%。

50mlph7.4的pbs于试管中,加入磷酸调节ph分别为
1.5、2.5、3.5、4.5、5.5和
6.5。
不同ph的wfmc-1:称取
1mg的wfmc-1利用超声仪充分分散于
1ml
不同ph的pbs(ph7.4)中配置为ph分别为
1.5、2.5、3.5、4.5、5.5和
6.5的
1mg/ml
的母液,再分别从母
液中吸取
300
μl于
700
μl的
1.5、2.5、3.5、4.5、5.5和
6.5的pbs中,最终配置为浓度为
300
μg/ml ph分别为
1.5、2.5、3.5、4.5、5.5和
6.5的wfmc-1pbs分散液。
不同浓度wfmc-1:称取
10mg的wfmc-1利用超声仪充分分散于ph4.5的
1ml pbs中配置为
10mg/ml
的母液,再分别从母液中吸取
10、20、30、40

50 μl于
990、980、970、960

950
μl的pbs中,最终配置为
100、200、300、400

500
μg/ml
的wfmc-1pbs分散液。tmb h2o2:

925μ
l tmb和 h2o275μl于
1.5ml
离心管中。tmb h2o2 wfmc-1:取
250
μ
l tmb、75μ
l h2o2、75μ
l wfmc-1(
300
μg/ml
)和
600
μ
lpbs于
1.5ml
离心管。ph对wfmc-1的催化性能:在
1.5ml
离心管中依次加入
75μl的wfmc-1(
300
μg/ml
)、600
μ
lpbs(ph分别为
1.5、2.5、3.5、4.5、5.5和
6.5)、250
μ
ltmb、75μ
l h2o2;不同浓度wfmc-1的催化性能:在
1.5ml
离心管中依次加入
75μl的wfmc-1(浓度依次为
100、200、300、400

500
μg/ml
)、600
μ
lpbs(ph 4.5)、250
μ
ltmb、75μ
l h2o2。
[0047]为了研究wfmc-1是否能产生
·oh,如图6(a)所示,使用紫外分光光度计测量tmb、tmb h2o2和tmb h2o2 wfmc-1的吸收光谱,可见tmb和tmb h2o2都无吸收,而tmb h2o2 wfmc-1出现明显的吸收峰,结果表明,wfmc具有良好的酶催化性能,能够催化
·oh的生成氧化tmb。
研究了wfmc浓度、激光功率强度以及激光照射对酶活力的影响。
图6(b)所示,wfmc-1的酶活性(
500
μg ml
−1)依赖于ph。

638nm处的紫外可见吸收随ph的降低而增加,在ph为
2.5时达到最大值。
随着ph值的降低,吸光度降低。
如图6(c)所示,wfmc-1的酶活性也随着聚合物浓度的增加而显著增加。
随后,测量了ph5.5和
6.5的吸收光谱,如图6(d)所示,ph5.5时有明显的紫外吸收。
[0048]试验例1:体外抗菌试验(1)细菌培养:本试验采用了e. coli和s. aureus两种细菌,利用二代细菌来完成以下实验。
二代细菌具体的培养方法为:首先复苏冻存的细菌,在
37°c的条件下将冷冻细菌融化,取
100
µl菌液于装有
5 ml lb液体培养基的摇菌管中,放置恒温摇床(
110rpm,
37℃
)培养
12h,取培养后的菌液
100
ꢀµl置于装有
900
µl的
2 ml 的ep管中,再按梯度稀释的办法按梯度
10-2稀释
5-10管,取每管中的菌液
100
µ
l,使用涂布棒均匀的涂在装有固体培养基的培养皿中,在
37℃
下孵育
24h,观察克隆形态与菌落数量,取菌落数大约为
1000
个的培养皿为一代细菌。
使用挑菌棒挑出一代细菌中的一个菌落加入装有
5ml lb液体培养基的摇菌管中,按培养一代细菌的方法培养得到菌落数大约为
1000
个的培养皿为二代细菌。
细菌溶液(e. coli或s. aureus)中的培养基为
lb液体培养基,具体的配置方法为取
lb肉汤
5g,分散于
200 ml
蒸馏水中,再使用高压灭菌的方式进行灭菌后即得
lb液体培养基。
固体培养基的具体配置方法为,取
lb肉汤
5g,琼脂
3g,分散于
200 ml
蒸馏水中,再使用高压灭菌的方式进行灭菌后即得固体培养基。
[0049](2)平板计数法测定wfmc-1的抗菌活性:经过对wfmc-1关于ptt和酶的性能测试,可以得出wfmc-1具有一定的抗菌潜力,用平板计数法研究了wfmc-1的激光照射诱导的抗菌能力。
其中,不同浓度的wfmc-1组细菌分散液的具体配置方法为:取wfmc-1粉末
10 mg,充分分散于
1 ml pbs中,配置成
10mg/ml
的wfmc-1母液,在6个
2 ml ep管中分别加入
100
ꢀµ
l 108cfu ml-1细菌溶液(e. coli或s. aureus),再分别加入
850、860、870、880、890

900
μl的pbs,再分别加入
50、40、30、20、10和0μl的
10mg/ml
的wfmc-1母液,配置为
500、400、300、200、100
和0μg/ml
的wfmc-1溶液。
然后使用激光照射不同浓度的wfmc-1溶液(激光的参数:
λ
=638 nm,
1.2w/cm2,
10min),不同浓度的wfmc-1溶液分别放置恒温摇床(
110 rpm,
37℃
)培养
12h,
然后按细菌培养的方式将培养后的菌液梯度稀释
105倍,将吹匀的菌液转移
100
μl到固体培养基中,并涂抹均匀,在
37℃
下孵育
24h,以观察克隆的形态。
计算菌落并与各组比较细菌活性。
如图
7-8所示,随着wfmc-1溶液浓度的增加,对金黄色葡萄球菌(s. aureus)和大肠杆菌(e. coli)的杀菌性能大大增强。wfmc-1溶液在
500
μg/ml
的浓度下,对大肠杆菌的抗菌率达
96.96±
0.33%,金黄色葡萄球菌的抗菌率达
98.39±
0.17%。
[0050]为了比较,还评估了wfmc-1不同处理下的体外抗菌能力。
还是利用平板计数法研究在不同处理下的抗菌能力。
将体外细菌实验分为七组:(i)pbs、(ii)wfmc-1、(iii)h2o2、(iv)h2o2
激光、(v)wfmc-1 h2o2、(vi)wfmc-1
激光、(vii)wfmc-1 h2o2
激光组。
不同组共培养溶液的配置方法为:首先取wfmc-1粉末
10 mg,充分分散于
1 ml pbs中,配置成
10mg/ml
的wfmc-1母液。
[0051]pbs组:在
2ml ep管加入
100
µ
l 108cfu ml-1细菌溶液,再加入
900
μl的pbs,得到pbs组。
[0052]wfmc-1组:在
2ml ep管加入
100
µ
l 108cfu ml-1细菌溶液,再加入
50
μl的wfmc-1母液,最后加入
850
μl的pbs得到wfmc-1组。
[0053]h2o2组:在
2ml ep管加入
100
µ
l 108cfu ml-1细菌溶液,再加入
870
μl的pbs,再加入
30
μ
l 的
30wt%
的h2o2,得到处理后的h2o2组。
[0054]h2o2
激光组:在
2ml ep管加入
100
µ
l 108cfu ml-1细菌溶液,再加入
870
μl的pbs,再加入
30
μl的
30%
的h2o2,再用激光件照射分散液,得到处理后的h2o2
激光组。
[0055]wfmc-1 h2o2组:在
2mlep管加入
100
μ
l108cfuml-1细菌溶液,加入
50
μl的
10mg/ml
的wfmc-1母液,加入
30
μl的
30%
的h2o2,再加入
830
μl的pbs,得到处理后的wfmc-1 h2o2组。
[0056]wfmc-1
激光组:在
2mlep管加入
100
μ
l108cfuml-1细菌溶液,加入
50
μl的
10mg/ml
的wfmc-1母液,再加入
850
μl的pbs,最后用激光件照射分散液,得到处理后的wfmc-1
激光组。
[0057]wfmc-1 h2o2
激光组:在
2mlep管加入
100
μ
l108cfuml-1细菌溶液,加入
50
μl的
10mg/ml
的wfmc-1母液,加入
30
μl的
30%
的h2o2,再加入
830
μl的pbs,最后用激光件照射分散液,得到处理后的wfmc-1 h2o2
激光组。
[0058]上述组中激光的参数均为:
λ
=638 nm,
1.2 w/cm2,
10min。
[0059]然后按照组别分别放置恒温摇床(
110 rpm,
37℃
)培养
12h,然后按细菌培养的方式将培养后的菌液梯度稀释
105倍,将吹匀的菌液转移
100 μl到固体培养基中,并涂抹均匀,在
37℃
下孵育
24h,以观察克隆的形态。
计算菌落并与各组比较细菌活性。
从图9(a)
~
(b)可以看出, 用(i)pbs、(ii)wfmc-1、(iii)h2o2、(iv)h2o2
激光、组处理的细菌,都呈现出大致相同的菌落数量。
但是,(v)wfmc-1 h2o2、(vi)wfmc-1
激光、(vii)wfmc-1 h2o2
激光组的抗菌效果有明显改善。
例如,(v)wfmc-1 h2o2的抗菌效率对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌存活率分别达到
45.5±
0.89%

49.4±
0.82%。
而经(vi)wfmc-1
激光组处理的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的存活率分别下降到
1.78±
0.13%

2.74±
0.13%。
(vii)wfmc-1 h2o2
激光组呈现出最突出的抗菌效果,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的存活率分别只有
0.45±
0.05%

0.83±
0.07%。
这是由于(vii)wfmc-1 h2o2
激光组结合了酶和光热(ptt)的抗菌能力,实现了协同的光热(ptt)酶杀菌效果。
总之,wfmc-1具有良好的协同ptt和酶抗菌能力,可以作为一种具有潜在抗菌能力的光谱抗菌剂来代替抗生素。
[0060]试验例2:细菌活/死染色试验syto-9和pi被用来区分活的和死的微生物细胞。syto-9能穿透所有的细菌膜(完整的和受损的),因此将细菌标记为绿色。
另一方面,pi只穿透受伤的细菌膜,将细菌标记为红色,同时减少syto-9的绿色。
[0061]按试验例1中的方法配置(i)pbs、(ii)wfmc-1、(iii)h2o2、(iv)h2o2
激光、(v)wfmc-1 h2o2、(vi)wfmc-1
激光、(vii)wfmc-1 h2o2
激光组的菌液。
之后取各个组的细菌悬液
100
µl与 20
ꢀµ
l syto-9(
1.0
×
10-3m)和
20
ꢀµ
l pi(
1.5×
10-3m)在
37℃
下黑暗中共孵育进行
15min。
染色后,将样品在pbs中离心,以去除多余的syto-9和pi。
然后将细菌重新悬浮在
50
µ
l pbs中,并放置在载玻片表面。
然后用荧光倒置显微镜捕捉大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的图像。
[0062]从图
10可以看出,活/死染色的结果与前述共培养实验的结果一致,不同处理下的两种细菌都呈现不同的荧光信号。
例如图
10中的i组、ii、ⅲ、ⅳ组所示,用pbs、wfmc-1、h2o2、h2o2
激光组处理的细菌,只呈现强烈的绿光荧光。
但是对于其他组的处理下的细菌,如图
10中的
ⅴ、vi组所示,用wfmc-1 h2o2、wfmc-1
激光处理组呈现出比pbs、wfmc-1、h2o2、h2o2
激光组得多的红色荧光。
如图
10中的vii组所示,wfmc-1 h2o2
激光组呈现出最突出的灭菌效果,其中几乎所有的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都被标记为红色。
进一步证明了wfm-1在协同ptt和酶抗菌方面的优越性。
[0063]试验例3:细菌透射电镜:按试验例1中的方法配置(i)pbs、(ii)wfmc-1、(iii)h2o2、(iv)h2o2
激光、(v)wfmc-1 h2o2、(vi)wfmc-1
激光、(vii)wfmc-1 h2o2
激光组的菌液。
之后,取细菌菌液
100
μl在
2.5wt%
戊二醛溶液中固定(
4℃,
2h),用pbs洗三次,嵌入琼脂并封锁。
然后用乙醇溶液(
30 wt %、50 wt %、70 wt %、90 wt%、95 wt %

100 wt %
)在室温下连续处理
10min使细菌脱水,接着用丙酮在室温下处理
3h,用包埋介质(环氧树脂)梯度浸润包埋(分别用丙酮和环氧树脂质量比
3:1、1:1、1:3分别浸透1小时,最后纯环氧树脂浸透过夜)阴性染色,在镍网上切片。
镍网被放在tem下观察,捕获细菌形态。
[0064]用金黄葡萄球菌和大肠杆菌的tem图像来观察不同组别处理的细菌膜的完整性。
如图
11所示,pbs、wfmc-1、h2o2、h2o2
激光组中,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌膜都是完整的,表明细菌的活力没有受到光的影响。
处理wfmc-1 h2o2组的细菌膜稍有损伤。
与活/死染色结果相似,wfmc-1
激光组处理后的,细菌膜也有不同程度的损伤。

11中的 vii组所示, wfmc-1 h2o2
激光组对其细菌膜的破坏最为严重,有大量的细菌内容物流出。
因此,具有协同酶和ptt抗菌能力的wfmc-1作为一种不含抗生素的广谱抗菌剂具有巨大的应用潜力,可以有效地杀死细菌。
[0065]试验例4:体外生物相容性实验:(1)溶血实验新鲜血液取自balb/c雌性小鼠(购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)。

1500 rpm离心
20min收集红细胞,然后用pbs洗涤三次。
将红细胞(
4% w/w)与wfmc-1(
100-500
ꢀµg/ml
)以
1:9(v/v)的比例在
37℃
下孵育
3h,然后以
12000 rpm离心
20min。
然后,将每组
100
μl上清液置于
96孔板中,用酶标仪在
570nm处测量每组的吸光度。
蒸馏水作为阳性对照,pbs作为阴性对照。
使用下列公式4计算溶血量:溶血量(
%

=
(a-an)/(ap-an)
×
100%
(公式4);
其中 "a "
是在红细胞中加入wfmc-1后取上清液得到的吸光度。" an "
是在红细胞中加入pbs后取上清液得到的吸光度(阴性对照)。" ap "
是在红细胞中加入蒸馏水后取上清液得到的吸光度(阳性对照)。
[0066]如图
12所示,wfmc-1在显示出抗菌活性的浓度范围内,只显示出少量(低于
2%
)或没有溶血活性。wfmc-1的溶血率随wfmc-1的浓度而变化,随着浓度从
100

500
μg/ml
的增加,溶血率从
1.08±
0.19%
上升到
1.79±
0.1%。
说明wfmc-1 具有良好的血液相容性,对红细胞膜没有或可以忽略的损害。
[0067](2)细胞毒性实验在
96孔板中,h9c2大鼠心肌细胞(来自中国科学院细胞库)以每孔5×
103个细胞的密度播种,每孔
180
µl细胞,在周围的重复孔中加入
200
µ
l pbs进行液体密封,以防止过度蒸发。
孵化
24h后,加入
20
µl不同浓度(
100-500
μg/ml
)的wfmc-1孵化
72h。
然后在每个孔中加入
20
µl的mtt(
4mg/ml
)溶液,在培养箱中培养
4h。4h后,吸出上清液并加入
150
µl二甲基亚砜,溶解mtt(四甲基偶氮唑蓝)。
在摇床上溶解
10min后,用酶标仪在
570nm处测量
96孔板的吸光度。
每组实验重复三次。
[0068]同时,为了进一步研究材料本身对正常细胞的不良损害,进行了wfmc-1对h9c2大鼠心肌细胞的细胞毒性试验。
如图
13显示了用不同浓度的wfmc-1(
100-500
μg/ml
)培养3天的h9c2大鼠心肌细胞的细胞活力。
可以清楚地看到,随着材料浓度的降低,相对细胞活力逐渐增加,其数值在所有实验浓度下都能保持大于
80%,表明对h9c2大鼠心肌细胞没有毒性。
所有这些结果证实,具有良好生物相容性的wfmc-1是细菌的选择性药剂。
[0069]试验例5:(1)体内伤口愈合实验:使用5周大的雌性balb/c小鼠(济南朋悦实验动物繁育有限公司)(每组n = 5,
15-20 g)建立伤口愈合模型,分为7组。
具体建模方法为:用乙醇溶液(
75%
)消毒后,在手术前将每只小鼠的背毛剃掉,形成一个d=5mm的伤口,然后用金黄色葡萄球菌(1×
106cfu/ml
)感染
24h。
然后用(ⅰ)pbs(
100
ꢀµ
l,对照组)、(ⅱ)wfmc-1(
100
ꢀµ
l,
500
ꢀµg/ml
)、(ⅲ)h2o2(
100
ꢀµl)、(ⅳ)h2o2
激光(
100
ꢀµ
l,
λ
=638nm,
1.2w/cm2,
10min)、(

)wfmc-1 h2o2(
100
µ
l,
500
µg/ml
)、(ⅵ)wfmc-1 激光(
λ
=638nm,
1.2w/cm2,
10min)和(ⅶ)wfmc-1 h2o2
激光(
100
µ
l,
500
µg/ml,
λ
=638nm,
1.2w/cm2,
10min)下分别处理感染的伤口,并在第
1、3、5、7和9天对伤口表面进行拍照,同时监测小鼠的体重。
使用图像分析程序(image.j, national institutes of health)测量伤口大小的变化。
[0070]具体方法为:金黄色葡萄球菌感染balb/c小鼠背部皮质受损伤口模型建立一天后,每组伤口处按上述用量处理伤口,即为伤口治疗。
第0天至第1天为建模时间,用金黄色葡萄球菌感染受损的伤口。
此外,分别在第
1、3、5、7和9天对小鼠的伤口进行拍照和记录。
如图
15所示,第1天显示的是小鼠背部伤口刚刚穿孔后一天的照片,可以看出所有的伤口都显示出细菌感染的特征。
第3天为提供了治疗两天后背部伤口的照片,所有组的伤口都有不同程度的收缩。
与pbs、wfmc-1、h2o2、h2o2
激光组的肿胀相比,用wfmc-1 h2o2、wfmc-1
激光、wfmc-1 h2o2
激光组的伤口在第5天已经开始结痂。
随着治疗时间的延长,不同治疗方法下的伤口进一步收缩。

16(a)显示了不同组的伤口伤口收缩率。
在第7天,伤口收缩率分别达到
84.4±
0.76%
(pbs)、70.3±
0.89%
(wfmc-1)、70.5±
0.1.19%
(h2o2)、70.7±
0.77%
(h2o2

光)、61.9±
0.15%
(wfmc-1 h2o2)、39.5±
0.87%
(wfmc-1
激光),以及
20.2±
1.29%
(wfmc-1 h2o2
激光)。
第9天wfmc-1 h2o2
激光组(
11.9±
1.4%
)的伤口几乎完全愈合,明显高于其他组。
从图
15最后一行的叠加伤口图可以更明显地看出,经wfmc-1 h2o2
激光组处理的伤口愈合情况要比无激光组好得多。
所有这些结果表明,与其他组相比,ptt和酶协同治疗可以加速伤口收缩。
同时,每天记录balb/c小鼠的体重以进一步比较。
如图
16(b)所示,在8天的治疗中,各组小鼠没有明显的行为异常,体重也没有明显变化。
[0071](2)体内生物相容性研究:组织染色实验(h&e染色和马松三染色)为了进一步研究各组小鼠的伤口愈合情况,采用苏木精和伊红(h&e)染色和马松三色染色来评估(1)体内伤口愈合试验中小鼠的伤口愈合情况。
如图
17所示,对感染金黄色葡萄球菌的伤口进行的组织学分析显示,所有组都不同程度地出现了新的毛细血管和皮肤生长。
最直观的可以看出,wfmc-1 h2o2
激光的伤口结痂面积最小,产生的毛细血管和皮肤最多,甚至生成少量毛囊,说明ptt和酶协同治疗后的愈合速度明显加快。
对照组的结痂面积最大,新的毛细血管和皮肤很少,而且有大量的炎症细胞。
因此,wfmc-1在协同ptt和酶后能更快地加速伤口重建。
[0072]为了研究wfmc-1的体内生物相容性,对balb/c小鼠的心、肝、脾、肺和肾进行组织切片和h&e染色。
如图
18所示,结果发现,各组的不同器官没有明显的炎症和形态学损伤。
[0073]以上所述仅为本技术的优选实施例而已,并不用于限制本技术,对于本领域的技术人员来说,本技术可以有各种更改和变化。
凡在本技术的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本技术的保护范围之内。
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