测量多重-尊龙凯时官方app下载

文档序号:36476797发布日期:2023-12-22 10:05阅读:6563来源:国知局
测量多重
测量多重rna表达的方法和系统
技术领域
1.本发明涉及下一代测序

更具体地,本发明涉及用于测量多重
rna
表达的方法和系统



背景技术:

2.临床上广泛将下一代测序
(ngs)
技术用于许多分子诊断测定,而不是
rna
表达

然而,目前还没有使用
ngs
进行多重
rna
定量的可靠方法

3.目前可用的通过
rna
测序的
rna
表达具有以下问题:
i)
临床相关基因定量效率低;
ii)
测量低表达水平但临床上重要的基因的准确性低,诸如
alk—
精准医学中最成功的靶标;
iii)
成本高,因为它只允许全基因组分析,而其中绝大多数基因组与临床无关;
iv)
不适用于最容易获得的临床样品,诸如
ffpe
肿瘤组织

除了主流
ngs
工作流程外,还需要通常与低多重能力
(
例如,
rt-qpcr
或数字
pcr)
相关的
rna
表达分析中的其他非
ngs
方法以及另外的样品和工作流程
(
例如,
rna-scope

nanostring)。
4.使用免疫检查点抑制剂
(ici)
的革命性癌症免疫疗法可能在多种癌症中带来持久的反应


ici
疗法受益的癌症患者为约
20-30
%,但是为了找到这些癌症患者目前所用的诊断方法是不理想的

5.研究人员花费很大努力来识别
ici
的预测标志物,包括
pd-l1
表达,肿瘤浸润淋巴细胞
(til)
,尤其是
cd
8
t
细胞5。
较高的
orr

pd-l1
的高表达相关,
pd-l1
肿瘤比例评分
(tps)
为1%或以上的患者和
tps

50
%或以上的患者的
orr
分别为
27
%和
39
%6。
目前,四种
pd-l1 ihc
测定7,8(22c3、28-8、sp142

sp263)

fda
批准作为
nsclc
中不同
ici(
分别为帕博利珠单抗

纳武利尤单抗

阿替利珠单抗和度伐利尤单抗
)
的伴随或补充诊断测定

然而,决定高
pd-l1
表达的临界值
(cutoffs)
在不同的研究中有所不同7(1

、5

、10
%或
50
% pd-l1
阳性细胞
)。
此外,目前的
ihc
测定识别
pd-l1
的不同表位
。ventana sp142

sp263
靶向
pd-l1
的胞浆域,而
22c3

28-8
克隆是针对细胞外结构域的表位产生的9,这可能解释了
sp142/sp263

22c3/28-8
之间的不一致8。
因此,用于
ici
响应预测的这种半定量方法并不完善,凸显了开发更精确的
pd-l1
定量方法的必要性

6.鉴于上述情况,仍然需要开发精确并快速地检测
rna
表达的新方法

此外,还需要识别
ici
的预测标志物,这对于精准医学至关重要



技术实现要素:

7.本发明的一个实施方案涉及一种通过同时富集靶序列和相应的
rna
并计算同一靶序列的
rna

dna
比值来测量样品中靶序列的
rna
表达水平的方法,包括以下步骤:
8.(a)

rna
反向转录为互补
dna(cdna)
,得到
cdna
和基因组
dna
的混合物;
9.(b)
将通用测序衔接子连接到步骤
(a)
中的
gdna

cdna
末端;
10.(c)
进行第一聚合酶链反应过程以产生包括互补序列的单链引物延伸产物,其中互补序列与
gdna、cdna
或其组合上的靶序列互补并且与通用测序衔接子互补;
11.(d)
进行第二聚合酶链反应过程以扩增单链引物延伸产物;以及
12.(e)
执行下一代测序过程并计算同一靶序列的
cdna
测序读数与
gdna
测序读数的相对比值,即,
rna

dna
比值,
13.其中,该靶序列选自基因序列

基因外显子及其组合的组

14.本发明的一个实施方案涉及一种治疗对象的癌症的方法,该方法包含以下步骤:通过使用本文提供的测量
rna
表达水平的方法测量靶序列的
rna
表达水平,并将免疫检查点抑制剂应用于对象

15.本发明的另一个实施方案涉及一种试剂盒,其用于实施如本文所述的通过同时富集靶
dna
和相应的
rna
并计算同一靶序列的
rna

dna
比值来测量样品中靶序列的
rna
表达水平的方法,该试剂盒包括:
16.(a)
用于将
rna
转录为互补
dna(cdna)
的逆转录酶;
17.(b)
将被连接到样品中
gdna

cdna
的末端的通用测序衔接子;
18.(c)
在相对于
cdna

gdna
上的靶序列为
3'
的位置与
cdna

gdna
序列结合的第一引物;以及
19.(d)
在第一引物和
cdna

gdna
上的靶序列之间的位置与靶序列结合的第二引物

附图说明
20.图
1a
示出了锚定多重
pcr
的示意性描述;
21.图
1b
示出了用于高精度
rna
表达的锚定连接引发
(anchored ligation priming for highly accurate rna expression

alpha-rna)、
基因特异性引物
(gsp1s)
以及它们的靠近外显子
/
内含子边界的
3'
嵌套引物
gsp2
的示意性描述;
22.图
2a
示出了正义引物和反义引物的表达数据之间的线性回归
(
左:
b2m
,右:
chmp2a)

23.图
2b
示出了
chmp2a
的外显子3表达数据与外显子6表达数据之间的线性回归;
24.图
2c
示出了
alk
在融合阳性样品
(

)
和融合阴性样品
(

)
中的
rna
表达图;
25.图
2d
示出
cd274(
编码
pd-l1)
外显子
3、4
和6与
pdcd1(
编码
pd-1)

rna
表达与
pd-l1
的蛋白表达之间的相关性;
26.图
3a
示出肿瘤组织的
pd-l1
免疫组织化学染色显示


50
%阳性细胞
(n

34)

《50
%阳性细胞
(n

138)

nsclc
患者的
kaplan-meier
生存曲线;
27.图
3b
示出具有通过肿瘤组织免疫组织化学
(ihc)
染色显示任何阳性细胞,即
》0

(

pd_l1.0
=2’
;n=
135)
和无阳性细胞,即0%
(

pd_l1.0
=1’
;n=
37)

pd-l1
蛋白表达的
nsclc
患者的
kaplan-meier
生存曲线;
28.图
3c
示出具有通过肿瘤组织免疫组织化学
(ihc)
染色显示

=1%阳性细胞
(

pd_l1.1
=2’
;n=
83)
和无阳性细胞
(

pd_l1.1
=1’
;n=
89)

pd-l1
蛋白表达的
nsclc
患者的
kaplan-meier
生存曲线;
29.图
3d
示出具有通过肿瘤组织免疫组织化学
(ihc)
染色显示

=5%阳性细胞
(

pd_l1.5
=2’
;n=
72)
和无阳性细胞
(

pd_l1.5
=1’
;n=
100)

pd-l1
蛋白表达的
nsclc
患者的
kaplan-meier
生存曲线;
30.图
3e
示出具有通过肿瘤组织免疫组织化学
(ihc)
染色显示


10
%阳性细胞
(

pd_
l1.10
=2’
;n=
57)
和无阳性细胞
(

pd_l1.10
=1’
;n=
115)

pd-l1
蛋白表达的
nsclc
患者的
kaplan-meier
生存曲线;
31.图
3f
示出具有通过肿瘤组织免疫组织化学
(ihc)
染色显示


25
%阳性细胞
(

pd_l1.25
=2’
;n=
41)
和无阳性细胞
(

pd_l1.25
=1’
;n=
131)

pd-l1
蛋白表达的
nsclc
患者的
kaplan-meier
生存曲线;
32.图
3g
示出具有通过
alpha-rna
方法显示
cd274
外显子6高
(n

40)

cd274
外显子6低
(n

117)

rna
表达的
nsclc
患者的
kaplan-meier
生存曲线;
33.图
3h
示出具有通过
alpha-rna
方法显示
cd274
外显子6高且外显子4低
(n

8)

cd274
外显子6高且外显子4高
(n

30)
以及
cd274
外显子6低
(“其他”;n=
117)

rna
表达的
nsclc
患者的
kaplan-meier
生存曲线;
34.图
4a
示出在
tcga
癌症类型中
cd274(
不同的外显子
)
的表达;
35.图
4b
示出根据统计学意义差异
(y
轴;-log10
变换
p

)

cd274
外显子高表达患者与
cd274
低表达患者死亡的
cox
回归计算风险比
(x-轴
)

36.图
4c
示出具有
cd274
外显子3高表达且外显子5低表达
(n

26)

cd274

cd274
外显子3高表达且外显子5高表达
(n

263)
以及
cd274
外显子3低表达
(n

674)

tcga nsclc
患者的
kaplan-meier
生存曲线;
37.图
5a
示出在接受免疫检查点抑制剂治疗后,具有通过
alpha-rna
方法显示
cd274
高表达且
gzma
低表达
(n

12)

cd274
高表达且
gzma
高表达
(n

4)

cd274
低表达
(n

7)

rna
表达的
nsclc
患者的
kaplan-meier
无进展生存曲线;以及
38.图
5b
示出在接受免疫检查点抑制剂治疗后,具有通过
alpha-rna
方法表达的
rna
显示
cd274
高表达且
prf1
低表达
(n

12)

cd274
高表达且
prf1
高表达
(n

3)
以及
cd274
低表达
(n

7)

nsclc
患者的
kaplan-meier
生存曲线

39.本技术的附图仅用于说明目的,并且不一定是按比例绘制

具体实施方式
40.除非另有特别规定,否则本文中的所有测试均在标准条件下进行,这包括
25℃
的室温和测试温度

海平面
(1
个大气压
)
压力
、ph7
,并且所有测量均以公制单位进行

此外,本文中所有百分比

比值等均按重量计,除非另有特别说明

应当理解,除非另有特别说明,本文中描述的材料化合物

化学品等通常是来自全球各个供应商的商品和
/
或行业标准物品

41.如本文所用,总生存期
(os)
被定义为从患者手术到患者最后一次随访或死亡之日的时间段

42.本发明的一个实施方案涉及通过同时富集靶
dna
和相应的
rna
并计算同一靶序列的
rna

dna
比值来测量样品中靶序列的
rna
表达水平的方法,包括以下步骤:
43.(a)

rna
反向转录为互补
dna(cdna)
,得到
cdna
和基因组
dna
的混合物;
44.(b)
将通用测序衔接子连接到步骤
(a)
中的
gdna

cdna
的末端;
45.(c)
进行第一聚合酶链反应过程以产生包括互补序列的单链引物延伸产物,其中互补序列与
gdna、cdna
或其组合上的靶序列互补,并且与通用测序衔接子互补;
46.(d)
进行第二聚合酶链反应过程以扩增单链引物延伸产物;以及
47.(e)
执行下一代测序过程并计算同一靶序列的
cdna
测序读数与
gdna
测序读数的相
对比值
(

rna

dna
比值
)。
48.如上所述的
rna

dna
比值表示每个拷贝
gdna

rna
表达水平的数量

本说明书涵盖了单链
gdna/cdna

5'
末端和双链
gdna/cdna
的任一末端或两端

在一些实施方案中,如果连接到单链
gdna

cdna
,则通用测序衔接子被连接到
gdna

cdna

5'
末端

在一些实施方案中,如果连接到双链
gdna

cdna
,则通用测序衔接子被连接到
gdna

cdna
的任一末端或两个末端

49.本技术开发了一种使用高精度
rna
表达的锚定连接引发
(anchored ligation priming for highly accurate rna expression

alpha-rna)
对生物样品中的多重基因
rna
表达进行准确定量的方法

不意在受理论约束,
alpha-rna
被认为是一种基于下一代测序
(ngs)
的新方法,可用于各种质量的临床样品,包括来自福尔马林固定石蜡包埋组织的经高度降解的
rna
,并因此在临床上广泛适用

例如,在癌症诊断中,
alpha-rna
可以准确地定量那些与癌症免疫相关的基因,包括
pd-1/pd-l1
和免疫微环境基因,诸如颗粒酶和穿孔素等
。alpha-rna
可用于指导癌症免疫疗法

50.在本文的实施方案中,第一聚合酶链反应过程包括以下步骤:
51.(i)
接触第一引物,第一引物在相对于
cdna

gdna
上的靶序列为
3'
的位置与
cdna

gdna
序列结合;
52.(ii)
通过聚合将第一引物延伸至包括连接的通用测序衔接子的末端,以产生单链引物延伸产物;
53.(iii)
将包括靶序列的互补序列的单链引物延伸产物与模板链
cdna

gdna
解离;以及
54.(iv)
任选地,重复步骤(i)至
(iii)
一次或多次

55.在本文中的实施方案中,第二聚合酶链反应过程包括在第一引物和
cdna

gdna
上的靶序列之间的位置将第二引物结合至序列的步骤

在本文的实施方案中,第二聚合酶链反应过程还包括将通用引物结合到衔接子互补序列的步骤

56.在本文中的实施例中,上述步骤(i)至
(iii)
重复约1个循环至约
100
个循环

例如,步骤(i)至
(iii)
重复约2个循环至约
100
个循环,或约5个循环至约
50
个循环,例如,约8个循环

约9个循环


10
个循环


20
个循环


30
个循环


40
个循环


50
个循环


60
个循环


70
个循环


80
个循环约
90
个循环或约
100
个循环

57.在本文的实施方案中,第二引物用于引发和富集
gdna

cdna。
不意在受理论约束,认为这允许针对同一引物进行
cdna

gdna
比值的准确计算,因为引物效率不是影响因素
(
换言之,“被抵消”)
,并且可以排除使用两种不同的引物,即一种用于
gdna
而另一种用于
cdna
,所引起的不同效率的影响

例如,如图
1b
所示,在基因组
dna

cdna
同时存在的情况下,外显子边界附近的单个引物可以引发和富集基因组
dna(
包含外显子和内含子
)

cdna(
跨越外显子的界限
)。
58.在本文中的实施方案中,所述样品选自福尔马林固定石蜡包埋
(ffpe)
组织

通过手术活检或针吸收集的新鲜组织

血液

尿液

腹水

胸腔积液

脑脊液

胰腺囊肿液及其组合组成的组

在一些实施方案中,用于测试的样品选自福尔马林固定石蜡包埋组织

通过手术活检或针吸收集的新鲜组织及其组合组成的组

在一些实施方案中,用于测试的样品选自液体活检,诸如血液

尿液

腹水

胸腔积液

脑脊液

胰腺囊肿液及其组合

在某些实施方
案中,样品可以是
ffpe
肿瘤组织,目前可用的通过
rna
测序的
rna
表达不适用于它

在某些实施方案中,样品可以是针刺活检组织,其材料的量有限并且目前可用的通过
rna
测序的
rna
表达不适用于它

59.在本文的实施方案中,该方法用于定量靶序列的表达,靶序列选自与以下相关的那些基因:免疫微环境
、t
细胞功能

抗原呈递

细胞毒性因子
、dna
损伤修复

免疫细胞粘附和迁移

管家基因和其他疾病相关基因

例如,在一些实施方案中,靶序列可以是选自
cd274、pdcd1、gzma、prf1
及其组合的组中的免疫微环境

在一些实施方案中,靶序列可以是选自
cd3d、cd3e、cd3g、cd6、cd8a、cd8b、foxp3、sh2d1a、tbx21、trat1
及其组合的组的
t
细胞功能

在一些实施方案中,靶序列可以是选自
atf3、b2m、ccr5、cd1c、cd36、cd4、cd74、cd8a、cd8b、cdc20、ctss、ctsw、cxcl1、cybb、dtx3l、fcgr1a、hla
基因
、ifng、irf8、itgav、mrc1、psmb10、psmb5、psmb8、psmb9、psmc4、socs1、tap1、tap2、tapbp、thbd、tnf、trim21、uba7、ubb、ube2c、ulbp2、vhl
及其组合的组的抗原呈递

在一些实施方案中,靶序列可以是选自
bbc3、cblc、cd47、cntfr、faslg、ghr、gnly、gzma、gzmb、gzmh、gzmk、gzmm、ifi16、ifi27、ifi35、ifi6、ifih1、ifit1、ifit2、ifit3、ifitm1、ifitm2、ifng、igf2r、il11ra、il12rb2、il22ra1、irf1、irf4、irf9、isg15、jak1、jak2、jak3、kir2dl3、kir3dl1、kir3dl2、klrb1、klrd1、klrk1、lif、mx1、oas1、oas2、oas3、prf1、prlr、sirpa、spry4、stat1、stat2、tnfsf10
及其组合的组的细胞毒素因子

在一些实施方案中,靶序列可以是选自
atm、blm、brca1、brca2、brip1、ccna1、ccno、cdk2、ddb2、ercc3、exo1、fanca、h2afx、isg15、mgmt、mlh1、msh2、msh6、nbn、neil1、parp4、pias4、pms2、pold1、polr2a、rad50、rad51、rad51c、tnks、tp53、uba7、ubb、ube2t、xcl1/2
及其组合的组的
dna
损伤修复

在一些实施方案中,靶序列可以是选自
cd2、cd274、cd276、cd28、cd4、cd40、cd40lg、cd58、cd6、cd80、cd86、cd8a、cd8b、cdh1、cdh2、cdh5、clec14a、clec4e、clec5a、clec7a、clecl1、ctla4、ctnnb1、cxcl12、cxcr4、cybb、icam1、icam2、icam3、icam5、icos、icoslg、itga1、itga2、itga4、itga6、itgae、itgal、itgam、itgav、itgax、itgb2、itgb3、itgb8、mmp9、ncam1、nectin1、nectin2、pdcd1、pdcd1lg2、pecam1、pik3ca、pik3cd、pik3cg、pik3r1、pik3r2、pik3r5、prkca、ptpn11、ptprc、pvr、rock1、sele、sell、selp、siglec1、thy1、tigit、vcam1、vcan、vtcn1
及其组合的组的免疫细胞粘附和迁移

在一些实施方案中,靶序列可以是选自
chmp2a、gapdh、b2m
及其组合的组的管家基因

在一些实施方案中,靶序列选自与免疫微环境

癌基因

肿瘤抑制基因及其组合相关的基因

60.在本文的实施方案中,总核酸在不去除基因组
dna
的情况下用于执行步骤
(a)
中的逆转录

不意在受理论约束,认为
gdna
可以用作完美的内部参考来计算每个基因组
dna
拷贝的
mrna。
61.在本文中的实施方案中,第一引物具有选自以下组的序列:
seq id no.1-379
,以及与
seq id no.1-379
中任一个具有至少约
80


至少约
90


至少约
95


至少约
98
%或至少约
99
%至约
100
%的同一性的其类似物

在一些实施方案中,第一引物可以具有选自
seq id no.1-379
和具有至少约
90
%同一性的其类似物中的任一个的序列

在一些实施方案中,第一引物可以具有选自
seq id no.1-379
以及具有至少约
98
%同一性的其类似物中的任一个的序列

在一些实施方案中,第一引物可以具有选自
seq id no.1-379
的任一个的序列

62.在本文中的实施方案中,第二引物具有选自
seq id no.380-758
以及与
seq id no.380-758
中的任一个具有至少约
80


至少约
90


至少约
95


至少约
98


或至少约
99
%至约
100
%的同一性的其类似物组成的组中的序列

在一些实施方案中,第一引物可以具有选自
seq id no.380-758
和具有至少约
90
%同一性的其类似物中的任一个的序列

在一些实施方案中,第一引物可以具有选自
seq id no.380-758
和具有至少约
98
%同一性的其类似物中的任一个的序列

在一些实施方案中,第一引物可以具有选自
seq id no.380-758
中的任一个的序列

63.不意在受理论约束,认为本文中
alpha-rna
方法的新颖性特征包括但不限于:
i)
使用基因外显子-内含子边界附近的单个引物来引发基因组
dna

rna(
逆转录为
cdna)

ii)
使用一种计算基因组
dna

rna
数量的新方法;
iii)
开发了一种基于相同引物的
rna

dna
数量的新比值来定量每个基因
/
细胞的
rna
表达水平,而没有传统方法中依赖于管家基因表达水平的需求,管家基因表达水平通常在不同组织和患者之间可变并且与不精确的定量有关

64.相应地,本发明的优点包括但不限于:
i)
定量临床相关基因的效率高;
ii)
测量低表达水平但临床上重要的基因的精度高;
iii)
具有成本效益,因为它允许对临床最相关的基因进行靶标富集和测序;
iv)
适用性广,并且可用于各种类型的临床样品,包括最容易获得但低质量的临床样品,诸如
ffpe
肿瘤组织;
v)
高多重能力
(
超过
100
重,足以进行临床诊断
)
;和
vi)
可以与主流
ngs
工作流程集成,无需额外样品或额外处理

65.基于广泛应用并成为临床诊断主要主力的下一代测序
(ngs)
技术,认为本文提供的
alpha-rna
方法可以为
ngs
开辟一个精确且有效地定量一组高度临床相关基因的
rna
表达的新领域
。alpha-rna
可用于指导癌症免疫疗法,正如发明人在接受检查点阻断免疫疗法的肺癌患者的临床研究中所证明的那样

66.本发明的一个实施方案涉及识别或确定可能对免疫检查点抑制剂有应答的对象
(
即,
ici
应答者
)
的方法,该方法包括从对象获得样品,然后使样品经受如本文所述的测量靶序列的
rna
表达水平的方法

67.在本文中的实施方案中,具有
cd274
的高表达和
gzma
的高表达的对象被识别或确定为对免疫检查点抑制剂有应答

在本文中的实施方案中,在单个外显子水平上具有
cd274
的高表达的对象被识别或确定为对免疫检查点抑制剂有应答

例如,对
ici
有应答的对象可能具有
cd274
外显子6的高表达

68.本发明的一个实施方案涉及一种治疗癌症的方法,包括向有需要的对象施用免疫检查点抑制剂,其中,在向对象施用免疫检查点抑制剂之前,通过使用本文所述的测量靶序列的
rna
表达水平的方法测试对象的
rna
表达水平

69.在本文中的实施方案中,对象具有
cd274
的高表达和
gzma
的低表达

70.确定靶序列的高表达或低表达没有金标准
/
临界值

然而,在本发明中,鉴于据报道约
20
%的
nslc
患者对
ici
3,4
有应答,我们根据患者组中
20
%的临界百分位数来定义高表达和低表达
(》20
%的百分位数为高表达,


80
%为低表达
)。
临界百分位数使用所有
nsclc
癌症患者的
rna
表达水平进行计算

71.在本文中的实施方案中,对象在单个外显子水平上具有
cd274
的高表达

例如,对
ici
有应答的对象可能具有
cd274
外显子6的高表达

72.不意在受理论约束,认为与传统
rna-seq
中通常可获得并且表示为
rpm(
每百万个
序列的读数
)
相比,精确到单个外显子水平的能力允许定量在某些情况下对疾病的发生

发展

药物应答和患者生存很重要的可变剪接的
mrna
变体

73.本文提供的方法适用于涉及
mrna
基因表达水平测试的任何组织类型的人类和动物癌症以及任何疾病

癌症和非癌症疾病

74.在一些实施方案中,癌症是非小细胞肺癌

75.在本文中的实施方案中,非小细胞肺癌选自腺癌

鳞状细胞癌

大细胞肺癌及其组合的组

在本文中的实施方案中,非小细胞肺癌选自腺癌

鳞状细胞癌及其组合

在本文中的实施方案中,非小细胞肺癌可以是鳞状细胞癌

76.在本文中的实施方案中,免疫检查点抑制剂选自
pd-1
抑制剂
、pd-l1
抑制剂及其组合的组

77.在本文中的实施方案中,免疫检查点抑制剂选自帕博利珠单抗

纳武利尤单抗

阿替利珠单抗

度伐利尤单抗及其组合的组

78.本发明的一个实施方案涉及一种试剂盒,其用于实施上述通过同时富集靶
dna
和相应的
rna
并计算同一靶序列的
rna

dna
比值来测量样品中靶序列的
rna
表达水平的方法,该试剂盒包括:
79.(e)
用于将
rna
转录成互补
dna(cdna)
的逆转录酶;
80.(f)
将被连接到样品中
gdna

cdna
末端的通用测序衔接子;
81.(g)
在相对于
cdna

gdna
上的靶序列为
3'
的位置与
cdna

gdna
序列结合的第一引物;和
82.(h)
在第一引物和
cdna

gdna
上的靶序列之间的位置与靶序列结合的第二引物

83.在本文中的一些实施方案中,第一引物具有选自由
seq id no.1-379
,以及与
seq id no.1-379
中的任一个具有至少约
80
%的相似性的其类似物组成的组的序列

在一些实施方案中,第一引物可以具有选自以下任一个的序列:
seq id no.1-379
和具有至少约
90
%相似性的其类似物

在一些实施方案中,第一引物可以具有选自以下任一个的序列:
seq id no.1-379
和具有至少约
98
%相似性的其类似物

在一些实施方案中,第一引物可以具有选自
seq id no.1-379
的任一个的序列

84.在本文中的实施方案中,第二引物具有选自由
seq id no.380-758
以及与
seq id no.380-758
中的任一个具有至少约
80
%的相似性的其类似物组成的组中的序列

在一些实施方案中,第一引物可以具有选自以下任一个的序列:
seq id no.380-758
和具有至少约
90
%相似性的其类似物

在一些实施方案中,第一引物可以具有选自以下任一个的序列:
seq id no.380-758
和具有至少约
98
%相似性的其类似物

在一些实施方案中,第一引物可以具有选自
seq id no.380-758
中的任一个的序列

85.免疫检查点抑制剂
(ici)
在非小细胞肺癌
(nsclc)
中已经显示出前所未有的临床活性,并极大地改变了
nsclc
的治疗方式1。
五种
ici
已被批准用于治疗
nsclc2,包括抗
pd-1
抗体帕博利珠单抗和纳武利尤单抗,抗
pd-l1
抗体阿替利珠单抗和度伐利尤单抗,抗
ctla
抗体伊匹单抗
(ipilimumab)
,其需要与纳武利尤单抗联合使用

尽管
ici
在一些患者中具有持久的应答和延长的生存期,但对于未经选择的
nsclc
患者,客观应答率
(orr)

20
%-30

3,4

86.不意在受理论约束,相信下一代测序
(ngs)
的发展提供肿瘤概况的分子和遗传特征的全面概述,这可能有助于
ici
生物标志物的发现

若干研究已发现,
pd-l1
的结构变化影
响对免疫疗法的应答

一篇文章报道,
pd-l1
的3’
区域中断导致其表达量增加,这使小鼠中
eg7-ova
肿瘤细胞能够免疫逃避

这种结构变化影响了多种癌症,包括成人
t
细胞白血病
/
淋巴瘤
(atl)、
弥漫性大b细胞淋巴瘤和胃腺癌
16

此外,一些文章报道了
pd-l1
的分泌型
(spd-l1)
的存在
17,18,19


ici10
治疗的预测性上
spd-l1
的功能还存在争议

一项研究报道了
pd-l1
的c端缺陷剪接变体是高度分泌的,且这种变体有助于
nsclc
中抗
pd-l1
治疗的耐药性
17

令人关注的是,另一篇文章发现,在
ici
期间
spd-l1
浓度升高,但它并不影响
nsclc
患者的生存期
18

因此,需要研究
nsclc

pd-l1
的结构变化,分析
pd-l1
的结构变化是否可以用作
nsclc
患者的预后标志

87.本发明开发了一种基于
ngs
的方法来检测
nsclc
患者的
mrna
表达
cd274(
编码
pd-l1)
及其各种剪接变体

本发明发现,通过
ngs
检测的
mrna
表达与通过
ihc(dako22c3)
检测的蛋白表达有良好的相关性

更重要的是,生存期分析显示,在所有
nsclc
患者中,
cd274
外显子3的高表达和
cd274
外显子5的低表达
(
编码
pd-l1
的分泌型和3’‑
utr
截短型
)

pd-l1
的其他剪接形式或低表达相比具有最差的总生存期
(os)。
这些结果表明,通过下一代测序检测
nsclc
患者的
pd-l1
表达可用于评估
nsclc
患者的预后,并指导个人免疫检查点疗法

此外,本文的实施例分析了用抗
pd1
疗法治疗的
nsclc
患者,并且生存期分析显示,
gzma

cd274
高表达的患者具有更长的无进展生存期
(pfs)。
不意在受理论约束,认为基于本文提供的
ngs
方法的个体化治疗可以改善非小细胞肺癌
(nsclc)

pd-l1
疗法效果

88.不意在受理论约束,认为
t
细胞浸润对癌症生存期和
ici
疗法也至关重要
10
。t
细胞浸润是胃癌
11

nsclc
12
的独立预测标志物,具有更高
cd8

til
密度的患者会有良好的生存期

另外,
cd8

t
细胞浸润增加的
nsclc
患者在
ici
疗法后可能有更长的
pfs
13

然而,患者仍可能因
t
细胞耗竭而在
ici
疗法中失败

认为肿瘤微环境中已耗竭的
t
细胞具有降低的效应细胞因子产生和细胞溶解活性,导致了癌症消除的失败
14

一篇文章显示,
t
细胞耗竭特征可以预测
ici
应答
15
,具有较高功能障碍得分的患者将有较差的生存期

因此,本文的实施例还将包括细胞毒性标志物,并与
pd-l1
相结合来预测
ici
疗法的生存期

89.实施例
90.实施例举例说明了基于下一代测序的方法,以定量
cd274(
编码
pd-l1)、
其剪接亚型
、t
细胞活性因子和其他遗传驱动因子的
mrna
表达,从而对
ici
疗法的患者分诊

该方法使用锚定连接引发高精度
rna
表达
(alpha-rna)。
实施例用两个回顾性的非小细胞肺癌
(nsclc)
队列对
alpha-rna
进行评估

队列i包括
182
名已经受手术切除的
nsclc
患者,具有可用的临床
ihc
检测结果并被随访以用于总体生存期分析

队列
ii
包括
33
名一线疗法已经失败并进一步接受抗
pd-1
疗法的患者,在此之前获得了穿刺活检,并在治疗后被随访以用于无进展生存期分析

在队列i中,通过
alpha-rna
评估的
cd274

mrna
表达与常规临床
ihc
蛋白表达高度相关
(r2=
0.51

p

《0.01)。
通过
alpha-rna

alk mrna
确实在那些
alk
融合阳性病例中表达,而在
alk
阴性病例中表达很低或没有表达

令人关注的是,
cd274
外显子6高表达且外显子4低表达的患者
(
可能类似于那些分泌型和3’
utr
截短型的
pd-l1
亚型
)
,与具有其他
cd274
剪接亚型的患者或具有低
cd274
表达的患者相比具有最差的总生存期
(p

《0.01)。
该发现与癌症基因组图谱
(tcga)
数据的分析结果一致

此外,发现
cd274
高表达且
gzma
低表达的患者对
ici
具有最好的应答和无进展生存期
(p

《0.01)
,表明除了
cd274
之外
gzma
可以是用于对接受
ici
疗法的患者进行分诊的另外的预测性标志物

总的来说,本文的
数据证明
alpha-rna
可以是指导癌症免疫疗法的多个基因及其亚型的
rna
表达的有效分子诊断测定

91.材料和方法
92.患者和标本
93.队列i回顾性地招募了
208
名于
2014
年至
2016
年间在中国浙江省杭州市浙江省肿瘤医院经受了手术切除的
nsclc
患者

根据世界卫生组织
(who)
的组织学分类和肿瘤-淋巴结转移
(tnm)
分类系统进行病理和临床病理分期诊断

总共包括
75
例鳞状细胞癌患者和
131
例腺癌患者,并记录基本临床参数

获得所有患者的书面知情同意,该研究获得浙江省肿瘤医院研究伦理委员会的批准
(irb-2018-24)。
94.免疫组织化学
(ihc)
95.通过手术收集的肺组织经过固定

脱水

透明化

浸泡和包埋,然后以4μm的厚度切片

表位去掩蔽
(epitope unmasking)
是通过抗原修复试剂完成的

用吐温
20

tris
缓冲盐水
(tbst)
洗涤后,将载玻片与一抗一起在
4℃
孵育过夜

然后按照制造商的说明,通过检测试剂盒检测
pd-l1
的表达

抗-pd-l1
抗体用于检测
pd-l1
的蛋白质水平

96.靶向
dna

rna
测序
97.实施例使用先前描述的锚定多重
pcr
方法进行靶向
dna

rna
测序
20

首先,使用
formapure xl rna
试剂盒
(
贝克曼库尔特生命科学,英国
)
从福尔马林固定石蜡包埋的肺组织样品中提取总核酸

在不去除基因组
dna
的情况下使用总核酸进行逆转录

简而言之,向样品
dna/rna
添加随机六聚体
(300ng/
μ
l)

dntp(10nm)
并在
65℃
下孵育5分钟以使
rna
变性

为了合成第一链
cdna
,添加
superscript iv
逆转录酶
(
产品目录号
18091050
,英杰公司
)

5x
缓冲液,
rnaseout
和新鲜
dtt
,并执行以下程序:
25℃ 10
分钟,
42℃ 30
分钟,
70℃ 15
分钟

然后通过在添加
dna
聚合酶
i(
产品目录号
m0209s
,新英格兰生物实验室
)、rnase h(
产品目录号
m0297s
,新英格兰生物实验室
)

10x
第二链反应缓冲液
(
产品目录号
b6117s
,新英格兰生物实验室
)
的情况下在
16℃
下孵育2小时来合成第二链
cdna。
然后用
1.8xampure xp
磁珠
(
产品目录号
a63881
,贝克曼库尔特公司
)
纯化逆转录产物

片段化的
gdna

cdna
混合物用衔接子连接,然后进行
15

pcr
扩增循环

扩增子产物经过纯化并用于半巢
pcr
,以富集所关注的靶标

实施例设计了靠近外显子
/
内含子边界的基因特异性引物
(gsp1)
及其3’
嵌套引物
gsp2。
在基因组
dna

cdna
都存在的情况下,外显子边界附近的单个引物可以引发并富集基因组
dna(
包含外显子和内含子
)

cdna(
跨越外显子的界限
)。
使用这种方法,可以计算每个富集引物的
rna

dna
比值,并将其用于定量
rna
表达水平

98.统计分析
99.执行
cox
风险比例回归分析以评估生物标志物和总生存期之间的关联

当双侧
p
值为
《0.05
时,差异被视为具有统计学意义

采用
r studio、survival

(https://cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html)

survminer

(https://cran.r-project.org/web/packages/survminer/index.html)
分析
pd-l1
与患者的生存期之间的关系

100.结果
101.靶向下一代测序和免疫组织化学
102.alpha-rna
方法基于锚定多重
pcr
,图
1a
和图
1b
示出了靶向
gdna

cdna
测序的示意
性描述

为了测试
ngs
方法的可靠性,用反义和正义计算了两个管家基因
chmp2a

b2m

rna

dna
比值

如图
2a
所示,在
chmp2a

b2m
中,反义
rna

dna
比值和正义
rna

dna
比值都具有极好的相关性,相关系数分别为
0.81(p《0.001)

0.86(p《0.001)。
在同一管家基因中,计算不同外显子的
rna

dna
比值,并且
chmp2a
外显子3的
rna

dna
比值与外显子6具有良好的相关性
(

2b)。alk
基因融合和
alk
表达也被定量

如图
2c
的箱形图所示,
alk
基因融合导致
alk
的上调,这与其他文章一致
。ihc
是目前
pd-l1
检测的标准方法,但其局限性是明显的

使用本发明的新方法,发明人定量
cd274
外显子3和5以及
pdcd1(
编码
pd-1)
外显子2和3的表达

此外,
pd-l1
的蛋白表达由
ihc
测定

结果表明,
cd274
外显子3和5的
rna
表达与
pd-l1
的蛋白表达水平相关
(
相关系数分别为
0.27

0.40

spearman
秩检验,图
2d)。pd-1(
外显子2和
3)

rna
表达与
pd-l1
蛋白表达不相关
(

2d)。
103.cd274
外显子3的高表达和
cd274
外显子5的低表达作为
nsclc
患者的不良预后标志物
104.接下来,发明人评估
pd-l1
表达
(
蛋白质和
rna
表达
)
与患者总生存期之间的关联

使用不同的
pd-l1 ihc
阳性肿瘤细胞百分比临界值,
pd-l1
表达高的患者在不同临界值下始终比
pd-l1
表达低的患者具有更短的
os(

3a
和图
3b-3f)。
然后,发明人研究了在外显子水平
/
亚型水平上
cd274

rna
表达是否可用于预测
nsclc
患者的生存期


3g
示出了
cd274
外显子6高表达的患者具有较好的
os。
还发现
cd274
外显子6高表达且外显子4低表达的患者
(
可能反映了跨膜结构域缺失的亚型
)
相比于其他表达的患者具有最差的
os(p

0.00028
,图
3h)。
进行单因素
cox
回归分析,并且显示不仅
pd-l1
蛋白水平,就连新的
pd-l1 rna

(cd274
外显子4低表达
(exon4)
和外显子6高表达
(exon6 ))
也都与生存期显著相关
(
下表
1)。
105.表1:在研究的非小细胞肺癌患者中
pd-l1
蛋白表达
(
在不同临界值百分位数下,
ihc
测定
)

pdl1 rna
表达
(
连续均值或二分类组,
alpha rna
测定
)
的风险比和
95
%置信区间,调整性别

年龄和吸烟状况,使用
cox
回归模型

[0106][0107]
使用癌症基因组图谱
(tcga)
数据验证
cd274
的预后作用
[0108]
关于
pd-l1

mrna
水平和
nsclc
临床结果的数据很少

因此,发明人分析了不同肿瘤类型的
tcga
数据,发现
cd274
在单个外显子水平上的高表达不会增加风险比
(

4a

4b)。
然而,在联合外显子分析中,
cd274
外显子3的高表达和
cd274
外显子5的低表达

该组可能类似于
pd-l1
的分泌型和3’‑
utr
截短型

在所有
nsclc
患者中与其他剪接形式相比具有最差的
os(

4c)。
[0109]
研究
gzma、prf1

cd274

nsclc
患者免疫检查点阻断疗法中的预测作用
[0110]

pd1/

pd-l1
疗法的成功在很大程度上取决于个体的免疫状态

因此,发明人想知道
cd8

t
细胞的状态及其抑制配体
pd-l1
的表达是否可以预测
nsclc
患者对抗
pd-1/pd-l1
疗法的应答

本实施例包括
38
名患者,其已经接受疗法且在治疗前已经进行了活检,并随访了治疗结果
(
疾病稳定
[sd]
,部分缓解
[pr]
和完全缓解
[pd])。
我们会使用上文描述的方法定量颗粒酶
a、
穿孔素
、pd1

pd-l1(
具有亚型
)
的表达

这些基因的表达通过管家基因
(champ

b2m)
标准化

通过
cd8
特征基因和
cd274
分析无进展生存期
(pfs)
,以研究
gzma、prf1

cd274
亚型在
nsclc
患者抗
pd-1/pd-l1
治疗结果中的预测作用

生存期分析表明,
gzma

cd274
双阳性患者在用
ici
治疗时具有最好的
pfs(

5a)
,但另一种
cd8
特征基因
prf1

cd274
联合不能改善
pfs(

5b)。
[0111]
讨论
[0112]
不意在受理论约束,认为
pd-l1

nsclc
患者中广泛表达,在腺癌和鳞状细胞癌中都是如此

肿瘤微环境中抑制性分子
pd-l1
的表达和
t
细胞的高度浸润表明那些耗竭的
t
细胞可能是肿瘤逃逸的原因

针对
pd-1/pd-l1
轴的免疫检查点抑制剂已经产生了巨大的临床受益,但鉴别
ici
应答者和非应答者的方法还开发不足

[0113]
本发明识别了
pd-l1
的新型转录物,它具有外显子6的高表达和外显子4的低表达

一篇文章已经报道了成人
t
细胞白血病
(atl)
患者中高分泌的
pd-l1
,大约
27
%的
atl
有这种
spd-l1
变体

在本文的实施例中,
155

nsclc
患者中8名有
ex6 ex4-转录物,这与先前的文章一致

具有
ex6 ex4-转录物的患者具有比其他患者差的生存期,但单变量和多变量
cox
回归显示本发明的新型转录物并不增加风险
(hr》1
,但
p

》0.05)
,需要更多的样品来阐明
ex6 ex4-转录物的功能

[0114]
为了验证
pd-l1
和其他免疫因子的预测功能,本发明人使用队列
ii
,其包含
33
名一线疗法失败并进一步接受抗-pd-1
疗法的患者,在此之前获得穿刺活检

结果证明,
cd274
高表达和
gzma
低表达的患者具有对
ici
的最好应答,这表明
cd274

gzma
的组合具有成为
ici
疗法的预测标志物的潜力

[0115]
虽然用这种方法可以识别应答者,但认为有些病人仍可能对
ici
产生耐药

许多遗传和表观遗传机制使得对
ici
疗法产生获得性耐药
21

在用
pd-1
阻断治疗的黑色素瘤患者中,
hla i
类分子的下调和
(b2m)
表达的缺失已被描述
22
。b2m
的缺失导致
mhc i
类的受损的细胞表面表达受损和缺陷的抗原呈递,其引起对
ici
疗法的耐药

利用根据本发明的方法,人们可以调整引物板并监测患者的免疫状态并联合
ici
和化疗,这可以释放更多的肿瘤抗原并产生足够的抗肿瘤
t
细胞

尽管如此,认为可替代的共同抑制性免疫检查点
(
例如,
ctla-4、tim-3、lag-3

vista)
的表达已经与
ici
的耐药有关
23
,因此为了改进方法,需要扩大引物板的范围

[0116]
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[0139]
应当理解,上述内容仅举例说明和描述实施例,从而可以实施本发明,在不背离本发明精神的情况下可对其进行修改和
/
或改变

[0140]
还应该理解,本发明的某些特征,为了清楚起见,是在分开的实施方案的情况下描述的,也可以在单个实施方案组合地提供

反之,为了简洁起见,在单个实施方案的情况下描述的本发明的各个特征也可以分开地或者以任何合适的子组合来提供

[0141]
本文具体引用的所有参考文献在此通过引用以其整体并入

然而,引用或并入这样的参考文献并不一定承认其作为本发明的现有技术的适当性

可引用性和
/
或可用性

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