一种融合蛋白、其制备方法及其应用-尊龙凯时官方app下载

文档序号:9446736阅读:566来源:国知局
一种融合蛋白、其制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品领域,更确切的讲是一种融合蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002] 细胞因子在机体免疫反应中起着不可替代的作用,白介素-21 (il21)是2000年被 发现的一种四螺旋束细胞因子,il21主要是由活化的cd4 化细胞分泌。其基因定位于四号 染色体长臂26-27 (4q26-27)位,编码产生的多肤前体是由162个氨基酸组成,后经过gly 酶切,在第31为断开形成含131个氨基酸残基、分子量为15kd的成熟il21分子。il21受 体il21r属于i型细胞因子受体,是由a链和yc链组成,受体分布广泛,主要存在于t细 胞、b细胞、nkt细胞、dc细胞及角质化细胞等表面。il21在固有免疫和适应性免疫中发挥 重要的调节作用,是一种重要的的免疫调节因子。由于il21分子量比较小,分子不稳定,在 体内容易降解,因此大制备困难。
[0003] 现有技术中的il21的制备方法复杂、成本高昂。现有技术中制备il21的方法中, 直接在大肠杆菌中上清表达,使用的载体为pgex4-t,表达产物带有gst标签,后期需要将 gst标签去除,工艺复杂、成本较高。也有在毕赤酵母中表达,使用的表达载体为ppic9k,即 通过高卡郝抗性筛选表达量价高的克隆,由于il21稳定性较差,因此制备困难。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一种具有较长半衰期且稳定性良好的细胞因子il21融合 蛋白,及其应用。
[0005] 本发明的另一目的是提供一种制备所述il21融合蛋白的方法。
[0006] 本发明的再一目的是提供一种制备il21蛋白的方法。
[0007] 在本发明的第一方面,提供了一种融合蛋白,所述融合蛋白具有式la或式ib所述 结构:
[0008]a-b-c (la),或
[0009]c-b-a (扣)
[0010] 其中,
[0011] a为包括白介素-21的多肤元件;
[001引 b为连接肤;
[0013] c为包括血清白蛋白的多肤元件;
[0014]"-"表示连接上述各元件的肤键。
[0015] 在另一优选例中,所述白介素-21为哺乳动物的白介素-21。优选地,所述白介 素-21为人白介素-21。
[0016] 在另一优选例中,所述血清白蛋白为哺乳动物的血清白蛋白。优选地,所述血清白 蛋白为人血清白蛋白。
[0017] 在另一优选例中,所述元件a的长度为100-200个氨基酸。
[0018] 在另一优选例中,所述元件a包含seqidno: 1中第30-162位所示的氨基酸序列 并且长度为133-170个氨基酸。
[0019] 在另一优选例中,所述元件a的氨基酸序列如seqidno. : 1中第30-162位所示。
[0020] 在另一优选例中,所述的元件c包含seqidn0:2中第25-609位所示的氨基酸序 列,并且长度为585-650个氨基酸序列。
[002。 在另一优选例中,所述元件c的氨基酸序列如seqidno. : 2中第25-609位所示。
[0022] 在另一优选例中,所述连接肤的长度为0-10氨基酸,较佳地为1-5个氨基酸。更 佳地,所述连接肤为ggggs。
[0023] 在另一优选例中,编码所述融合蛋白的核巧酸序列如seqidno. : 4所示。
[0024] 在另一优选例中,所述融合蛋白具有w下特性:
[00巧]a)具有免疫调节活性;
[0026] 能够调节免疫细胞分化,提高nk细胞,ctl细胞杀伤活性;
[0027] b)可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭,促进肿瘤细胞的调亡;和
[002引c)血浆半衰期> 3天。较佳地> 4天,最佳地> 5天。
[0029] 在另一优选例中,所述免疫调节活性是指所述融合蛋白能够调节免疫细胞分化, 提高nk细胞和/或提高ctl细胞杀伤活性。
[0030] 在另一优选例中,所述可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭是指所述融合蛋白能够抑制 黑色素瘤细胞迁移和侵袭和/或促进化rkat细胞调亡。
[0031] 在本发明的第二方面,提供了一种分离的多核巧酸,所述多核巧酸编码根据本发 明第一方面的融合蛋白。
[003引在另一优选例中,所述的多核巧酸序列如seqidn0:4所示。
[0033] 在本发明的第h方面,提供了一种载体,所述载体包括根据本发明第二方面的多 核巧酸。
[0034] 在本发明的第四方面,提供了一种宿主细胞,
[0035] 所述宿主细胞表达根据本发明第一方面的融合蛋白;和/或
[0036] 所述宿主细胞含有本发明第h方面所述的载体;和/或
[0037] 所述宿主细胞基因组中整合有本发明第二方面所述的多核巧酸。
[0038] 在另一优选例中,所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞(如酵母细胞)。
[0039] 在另一优选例中,所述宿主细胞为毕赤酵母gs115菌株。
[0040] 在本发明的第五方面,提供了一种制备融合蛋白的方法,包括步骤:
[0041] 在适合表达的条件下,培养第四方面所述的宿主细胞,从而表达出第一方面所述 的融合蛋白;和
[0042] 分离所述融合蛋白。
[0043] 在另一优选例中,所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。优选地,所述宿主细胞为 酵母细胞。更优选地,所述酵母细胞为毕赤酵母,如gs115菌株。
[0044] 在本发明的第六方面,提供了一种制备白介素-21或其类似物的方法,所述方法 选自:
[0045] (a)将本发明第一方面的融合蛋白降解为白介素-21或其类似物;和
[0046] 分离纯化所述白介素-21或其类似物;和
[0047] (b)将白介素-21基因在含有稀有密码子的大肠杆菌菌株中表达白介素-21包涵 体。
[0048] 在另一优选例中,所述化)中大肠杆菌菌株为化21 (rp)菌株。
[0049] 在另一优选例中,所述化)中还包括将所述包涵体复性的步骤。
[0050] 在本发明的第走方面,提供了一种药物组合物,所述组合物包含:
[0051] 第一方面的融合蛋白,w及药学上可接受的载体或赋形剂。
[0052] 在本发明的第八方面,提供了本发明第一方面所述的融合蛋白的用途,用于制备 治疗疾病的药物。
[0053] 在另一优选例中,所述的疾病选自;肿瘤和低蛋白血症。
[0054] 在另一优选例中,所述肿瘤包括;大肠癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾细胞癌和/ 或结肠癌。
[0055] 应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可w互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在 此不再一一累述。
【附图说明】
[005引图1显示人血清白蛋白化sa)基因和il21基因pcr、融合基因化u拼接pcr电泳 图谱。
[0057] 图2显示线性化处理ppic9-hi质粒,回收鉴定电泳图谱。
[0058] 图3显示毕赤酵母表达融合蛋白(80邸左右),sds-page检测图谱,其中1-6泳道 为融合蛋白服a-il21在gs115中表达鉴定电泳,可见融合蛋白在gs115中有表达。
[0059] 图4显示融合蛋白hsa-il21产物纯化后电泳图谱。
[0060] 图5显示il21的pcr电泳结果。
[0061] 图6显示il21在大肠杆菌化21中的表达情况。
[006引图7显示il21在含有稀有密码子的化21触)菌株中的表达情况。
[0063] 图8显示il21和融合蛋白hsa-il21的活性检测结果。
[0064] 图9显示融合蛋白hsa-il21的安全性检测结果。
[0065]图10显示包涵体表达的il21的稳定性(sds-page检测),其中图10a为刚复性成 功的il21蛋白;图10b为-2(tc保存2周的il21蛋白;图10c为-2(tc保存3个月的il21 蛋白;图10d为-2(tc保存约6个月的il21蛋白。
[0066]图11显示包涵体表达的il21的稳定性(native-page检测),其中图11a为刚复 性成功的il21蛋白;图11b为-2(tc保存2周的il21蛋白;图11c为-2(tc保存3个月的 il21蛋白;图11d为-2(tc保存约6个月的il21蛋白。
[0067]图12显示融合蛋白hsa-il21的稳定性(sds-page检测),其中图12a为刚纯化的 融合蛋白hsa-il21;图12b为-20°c保存两周的融合蛋白hsa-il21;图12c为-20°c保存h 个月的融合蛋白hsa-il21;图12d为-2(tc保存六个月的融合蛋白hsa-il21。
[0068] 图13显示现纯化的融合蛋白hsa-il21的western-blot检测其降 解情况。图13a中一抗为鼠抗人il21-ab,二抗为兔抗鼠igg-hrp;图13b中一抗为鼠抗人 his-tag-ab;二抗为兔抗人igg-hrp。
[0069] 图14显示融合hsa-il21的体内半衰期。
[0070] 图15显示了不同保存时间的融合蛋白和il21的生物活性。
[0071] 图16显示il21-linke;r-hsa融合蛋白在毕赤酵母中无法表达。
【具体实施方式】
[0072] 本发明人通过广泛而深入的研究,意外地获得了一种通过酵母发酵制备il2u白 介素-21)的方法,该方法中将il21基因与人血清白蛋白基因n端融合,构建到酵母表达载 体中,
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