用于个人化医疗和药物开发的微器官球体的制作方法-尊龙凯时官方app下载

文档序号:36405535发布日期:2023-12-16 11:45阅读:20来源:国知局
用于个人化医疗和药物开发的微器官球体的制作方法
用于个人化医疗和药物开发的微器官球体(micro-organosphere)
1.相关申请案的交叉参考
2.本技术案主张
2020

11

25
日申请的第
63/118,527
号美国临时申请案的优先权,所述案的内容是以全文引用的方式并入本文中

技术领域
3.本公开大体上涉及个人化医疗和药物开发,且特别涉及产生微器官球体
(micro-organosphere)
且将其用于个人化医疗和药物开发



背景技术:

4.模型细胞和组织系统可用于生物和医学研究

最常见的实务是从组织衍生出永生化细胞系且将其培育于二维
(2d)
条件下
(
例如在培育皿或孔板中
)。
虽然对于基础研究有用,但
2d
细胞系与个别患者对疗法的反应没有很好的相关性

三维
(3d)
细胞培育模型在发育生物学

疾病病理学

再生医疗

药物毒性和功效测试

和个人化医疗中证明尤为有帮助

例如,类球体和类器官
(organoid)
是已研究过的
3d
细胞聚集体

然而,类器官和类球体具有减少其功效的限制

5.类器官是活体外衍生的细胞聚集体,其包括可分化成主要细胞谱系的细胞的干细胞群体

类器官通常具有超过
1mm
的直径

其通常比
2d
细胞培育更慢地生长和扩增

为了从临床样本产生类器官,输入样本必须含有成千上万个活细胞;因此,类器官经常无法由低体积样本,如由生检制成;且当可制成其时,其必须在准备好用于实验使用的前培育几周

类器官在大小

形状和细胞数量上还高度可变

因此,另外
3d
组织模型系统

装置和方法可为期望的



技术实现要素:

6.本公开大体上涉及用于形成微器官球体的系统和方法

一方面,本公开提供一种包含微器官球体产生器的系统,所述微器官球体产生器包括微流体装置且经结构设计成由生物样本和流体的混合物形成微器官球体组

控制器可经耦接到成像装置

控制器可经结构设计成接收对应于所述混合物或所述微器官球体组中的一者或多者的成像数据,且至少以成像数据为基础来估算所述微器官球体组的一种或多种特性

7.在一些变型中,成像装置可经结构设计成产生对应于所述混合物或所述微器官球体组中的所述一者或多者的所述成像数据

在一些变型中,细胞培育容器可经耦接到成像装置且经结构设计成培育微器官球体组于多个孔中

控制器可经结构设计成至少以成像数据为基础来估算所述多个孔中的微器官球体数

在一些变型中,细胞培育容器可经耦接到成像装置且经结构设计成培育微器官球体组于多个孔中

控制器可经结构设计成至少以成像数据为基础来估算所述多个孔中的微器官球体数

8.在一些变型中,一个或多个传感器可经耦接到微流体装置且经结构设计成产生对
应于混合物或微器官球体组的传感器数据

控制器可经结构设计成从所述一个或多个传感器接收传感器数据,且至少以传感器数据为基础来估算微器官球体组的一种或多种特性

在一些变型中,一个或多个泵可经耦接到微流体装置且经结构设计成控制流体流动到微流体装置

温度调节器可经耦接到微流体装置

样本源或流体源,且经结构设计成控制样本源

流体源

混合物或微器官球体组的温度

控制器可经结构设计成至少以成像数据和传感器数据为基础来修改所述泵或温度中的一者或多者

9.在一些变型中,聚合器可经流体耦接到微流体装置且经结构设计成使混合物聚合以形成微器官球体组

在一些变型中,去乳化器可经流体耦接到微流体装置且经结构设计成使混合物去乳化以形成微器官球体组

在一些变型中,去乳化器可包括经结构设计成分离微器官球体组的分流器

在一些变型中,分流器可沿着去乳化器的长度延伸

在一些变型中,搅拌器可经结构设计成搅拌以预定浓度于流体中的微器官球体

10.在一些变型中,所述微器官球体组的所述特性中的所述一者或多者可包括微器官球体直径

细胞总数或活细胞数中的一者或多者

在一些变型中,控制器可经结构设计成至少以成像数据为基础来估算所述混合物的一种或多种特性

在一些变型中,所述混合物的所述特性中的所述一者或多者可包括细胞总数和活细胞数

11.在一些变型中,成像数据对应于生物样本,且控制器可经结构设计成至少以成像数据为基础来估算生物样本的一种或多种特性

在一些变型中,所述生物样本的所述特性中的所述一者或多者可包括细胞总数和活细胞数

在一些变型中,所述微器官球体组可包含介于约
200
μm与约
400
μm之间的直径

12.在一些变型中,微器官球体产生器可经结构设计成从包含高达约
1ml
的体积的生物样本形成微器官球体组

在一些变型中,微器官球体产生器可经结构设计成从包含少于约
10,000
个细胞的生物样本形成微器官球体组

在一些变型中,生物样本可包含约
3,500
个细胞到约
7,500
个细胞

13.在一些变型中,微器官球体产生器可经结构设计成从具有约5μ
l
到约
5ml
的体积的生物样本形成微器官球体组

在一些变型中,生物样本可具有约5μ
l、

10
μ
l、

20
μ
l、

35.3
μ
l、

50
μ
l、

100
μ
l、

250
μ
l、

500
μ
l、

1ml、

1.5ml、

2ml、

2.5ml、

3ml、

3.5ml、

4ml、

4.5ml
或约
5ml
的体积

14.在一些变型中,微器官球体组可包括非细胞物体组

在一些变型中,所述非细胞物体组可包含一个或多个惰性粒子

在一些变型中,所述非细胞物体组可包含约1个惰性粒子到约
5,000
个惰性粒子

15.本公开的另一个方面涉及一种系统,其包括微器官球体产生器,所述微器官球体产生器经结构设计成由生物样本和流体的混合物形成微器官球体组,和控制器,所述控制器经结构设计成接收对应于微器官球体组的成像数据,且至少以成像数据为基础来识别包含介于约
50
μm与约
500
μm之前的直径的微器官球体组

16.在一些变型中,成像装置可经结构设计成产生对应于微器官球体组的成像数据

在一些变型中,生物样本对应于患者生检

17.本公开的另一个方面涉及一种于系统中制备微器官球体组合物的方法,所述方法包括提供包含离散细胞和未聚合的基材的生物样本,从所述生物样本在不可混溶的溶液中形成混合物,和使所述混合物聚合以形成微器官球体组

18.在一些变型中,所述生物样本可经解离以得到离散细胞

在一些变型中,所述基材可为温度敏感型且在混合物的温度增加时发生聚合

在一些变型中,所述微器官球体组可包含介于约
50
μm与约
500
μm之间的平均直径,所述平均直径的变异系数
(cv)
小于约
30

cv、
小于约
20

cv
或小于约
10

cv。
19.在一些变型中,所述微器官球体可按大小分选以形成包含介于约
50
μm与约
500
μm之间的平均直径的微器官球体组,所述平均直径的变异系数
(cv)
小于约
30

cv、
小于约
20

cv
或小于约
10

cv
,或一个或多个流速可经在微器官球体产生器内控制以形成包含介于约
50
μm与约
500
μm之间的平均直径的微器官球体组,所述平均直径的变异系数
(cv)
小于约
30

cv、
小于约
20

cv
或小于约
10

cv。
20.在一些变型中,可对微器官球体进行检定以测定治疗反应

在一些变型中,所述检定可为细胞存活率检定或细胞上色
(cell painting)
检定

在一些变型中,所述检定可在从患者得到生物样本时起
14
天或更短时间内进行

在一些变型中,微器官球体可包含约1个离散初生细胞到约
1,000
个离散初生细胞分布于基材内

在一些变型中,生物样本可对应于患者生检

21.本公开的另一个方面涉及一种包含多个微器官球体的微器官球体组合物,其中各微器官球体包含基材和至少一种类器官

所述多个微器官球体可包含参数,所述参数包括每个液滴的预定细胞数

组合物中的预定液滴数和
/
或预定液滴大小

所述参数中的每一者可独立地包含变异系数
(cv)
,其小于约
30

cv、
小于约
20

cv
或小于约
10

cv。
22.在一些变型中,组合物中各微器官球体的平均直径可介于约
50
μm与约
500
μm之间

在一些变型中,组合物中各微器官球体的平均直径可包含变异系数
(cv)
,其小于约
30

cv、
小于约
20

cv
或小于约
10

cv。
23.在一些变型中,各微器官球体可包含基材和仅一种类器官

在一些变型中,各微器官球体可包含惰性粒子

在一些变型中,所述惰性粒子可为磁性粒子

可磁化粒子

荧光粒子或其组合

在一些变型中,各微器官球体可包含约1个惰性粒子到约
5,000
个惰性粒子

24.在一些变型中,所述多个微器官球体可包含来自患者生检的组织

在一些变型中,所述组织可包含非培育细胞

在一些变型中,微器官球体可包含约1个离散初生细胞到约
1,000
个离散初生细胞分布于基材内

25.本公开的另一个方面涉及一种将微器官球体固定于孔或培育板中的方法,所述方法包括提供多个微器官球体,各微器官球体包含基材

至少一种类器官和磁性或可磁化粒子,且施加磁场到所述孔或培育板,由此将所述微器官球体固定到所述孔或培育板的表面

26.在一些变型中,所述孔或培育板具有底部,和将所述微器官球体固定到所述孔或培育板的底部

27.本公开的另一个方面涉及一种将微器官球体固定于具有底部的孔或培育板中的方法,所述方法包括提供多个微器官球体,各微器官球体包含基材和至少一种类器官,用结合所述基材的抗体使所述底部功能化,和使所述微器官球体与所述抗体接触,由此将所述微器官球体固定到所述底部

28.在一些变型中,所述抗体可通过培育固定于所述底部上

在一些变型中,所述底部可在功能化之前用蛋白a和
/
或蛋白g涂覆

29.本公开的另一个方面涉和一种测定患者对治疗的反应的方法,所述方法包括对微
器官球体进行检定,其中所述微器官球体是通过将来自患者的包含离散细胞的生物样本与未聚合的基材在不可混溶的溶液中混合以产生混合物,和使所述混合物聚合以形成微器官球体组来产生

30.在一些变型中,所述检定可为细胞存活率检定或细胞上色检定

在一些变型中,所述检定可在从患者得到生物样本时起约
14
天或更短时间内进行

在一些变型中,微器官球体可包含约1个离散初生细胞到约
1,000
个离散初生细胞分布于基材内

31.将从以下详细描述且透过本发明的实务明了本发明的另外变型

特征和优点

附图说明
32.图1为微器官球体形成系统的例示性变型的方块图

33.图
2a
为微器官球体形成系统的例示性变型的示意图


2b
为去乳化器的例示性变型的示意图


2c
为微器官球体形成系统的另一例示性变型的示意图


2d
为微器官球体形成系统的另一例示性变型的示意图

34.图
3a
为微器官球体形成系统的例示性变型的示意图


3b
为微器官球体形成系统的另一例示性变型的示意图

35.图
4a
为微器官球体形成系统的例示性变型的平面图


4b
为呈封闭结构的描绘于图
4a
中的微器官球体形成系统的透视图


4c
为呈开放结构的描绘于图
4a
中的微器官球体形成系统的透视图

36.图5为微器官球体产生器的例示性变型的横截面视图

37.图
6a
为去乳化器的例示性变型的示意图


6b
为去乳化器的例示性变型的横截面视图

38.图7为微器官球体形成系统的例示性变型的图像

39.图8为形成微器官球体的方法的例示性变型的流程图

40.图9为形成微器官球体的方法的另一例示性变型的流程图

41.图
10
为估算生物样本和混合物的方法的例示性变型的方块图
。qc
是指质量控制

42.图
11
为估算微器官球体的方法的例示性变型的方块图

43.图
12
为输出微器官球体的方法的例示性变型的方块图

44.图
13
为估算微器官球体的方法的另一例示性变型的方块图

45.图
14
为通过成像装置的例示性变型产生的图像

46.图
15a
为包含处于不同发育阶段的类器官的微器官球体的例示性变型的图像

47.图
15b
为微器官球体内类器官发育的例示性变型的点图

48.图
16
为比较第3天的乳癌微器官球体与第3天的常规类器官的例示性变型的图像

49.图
17
为产生包含非细胞物体的微器官球体的例示性变型的示意图

50.图
18a

18b
为描绘用小鼠抗层连结蛋白和
/
或小鼠抗-胶原蛋白
iv
抗体经由直接结合到聚苯乙烯
(

18a)
或蛋白a介导的附着
(

18b)
衍生培育板的例示性变型的线图

51.图
19
为产生微器官球体的例示性变型的示意图

具体实施方式
52.本文描述用于形成微器官球体
(
例如液滴

液滴微器官球体
(dmos))
的系统和方


在一些变型中,可使用微器官球体来筛选药物组合物以预测可施用到患者的有效疗法

例如,药物或其它化学组合物的毒性筛选可以包含来自患者的健康组织和
/
或癌
(
例如肿瘤
)
组织的微器官球体为基础进行

53.在一些变型中,微器官球体可经结构设计成封装一个或多个活细胞,包括但不限于癌细胞

基质瘤细胞

细胞系

其组合等以用于培育

例如,所述系统和方法可产生具有预定大小或大小分布与预定细胞数

和预定浓度的微器官球体

54.在一些变型中,微器官球体组可从患者衍生的已解离且悬浮于基础基质
(
例如
)
中的肿瘤样本形成

在一些变型中,微器官球体可经图案化到微流体微孔数组上以进行培育且给予一种或多种药物化合物

这种微型化检定可实现从小肿瘤样本的高效药物筛选

55.如本文所用,术语“微器官球体”可指由固体或半固体基材形成的液滴,其包含经培育以形成类器官的细胞,其中所述液滴具有介于约
50
μm与约
500
μm之间

介于约
50
μm与约
400
μm之间

介于约
50
μm与约
300
μm之间和介于约
50
μm与约
250
μm之间
(
包括之间的所有值和子范围
)
的直径

在一些变型中,基材可包括细胞外基质
(
例如水凝胶,如
)。
微器官球体可包括一种

两种

三种

四种

五种或更多种类器官

在一些变型中,微器官球体可最初包含介于约1个与约
1,000
个之间的离散初生细胞分布于基材中,介于约1个与约
750
个之间

介于约1个与约
500
个之间

介于约1个与约
400
个之间

介于约1个与约
300
个之间

介于约1个与约
200
个之间

介于约1个与约
150
个之间

介于约1个与约
100
个之间

介于约1个与约
75
个之间

介于约1个与约
50
之间

介于约1个与约
40
之间

介于约1个与约
30
之间和介于约1个与约
20
个之间,包括之间的所有值和子范围

在一些变型中,微器官球体进一步包含惰性粒子

在一些变型中,所述惰性粒子为磁性粒子

可磁化粒子

荧光粒子或其组合

56.在一些变型中,系统可任选地包括微器官球体产生器,其经结构设计成由生物样本和流体的混合物形成微器官球体组

成像装置可经结构设计成产生对应于所述微器官球体组的成像数据

控制器
(
例如处理器和存储器
)
可经耦接到成像装置,且控制器可经结构设计成从成像装置接收成像数据,且以成像数据和
/
或其它传感器数据为基础识别具有在预定范围
(
例如,介于约
50
μm与约
500
μm之间
)
内的直径的所述微器官球体组

例如,微器官球体组的一种或多种特性可至少以成像数据为基础来估算

57.形成本文所述的微器官球体的系统和方法可增加速度

通量

一致性或异质性中的一者或多者

相反地,常规类器官为活体外衍生的细胞聚集体,其通常具有大于约
1mm
直径的直径,且具有类器官大小

形状和细胞数量的大变异量

其还需要大量活细胞
(
例如成千上万个
)
且花费延长的时间期
(
例如月
)
进行培育和扩增

58.i.
系统
59.综述
60.此处描述经结构设计成形成微器官球体的系统和设备

在一些变型中,微器官球体可以预定标准
(
例如大小

数量

密度
)
为基础来形成

微器官球体形成可包括产生

聚合和去乳化中的一个或多个步骤

图1为包括微器官球体产生器
110、
样本源
130、
任选的成像装置
132、
流体源
134、
废液容器
136、
聚合器
140、
去乳化器
150、
输出
152
和计算装置
160
的微器官球体形成系统
100
的方块图

在一些变型中,微器官球体产生器
110
可包括微流体装置
112(
例如微流体芯片
)、
开关
114、
传感器
116、
温度调节器
118、

120
或平台
122
中的一者或
多者

在一些变型中,计算装置
160
可包括处理器
162、
存储器
164、
通讯装置
166、
输入设备
168
和显示器
170(
例如输出装置
)。
61.本文所述的系统提供优于常规类器官产生方法的许多优点

例如,通过微器官球体系统
100
产生的微器官球体中的细胞可确立且比接种于常规类器官中的细胞更快生长

在一些变型中,本文所述的微器官球体可以高通量
(
例如数百万个
/
小时
)
产生且所述系统可与其它高通量筛选装置兼容

此外,每孔接种的液滴数可以预定方式进行控制

例如,本文所述的系统可通过控制液滴大小且确保液滴小于吸移管尖端的孔大小
(bore size)
或现有技术的信道直径而与机器人液体处置系统的一个或多个组件兼容

机器人液体处置系统的组件一般包括微板分配器

液体处置器和多孔板
(
例如
24
孔板
、48
孔板
、96
孔板
、1536
孔板
)。
本文所述的系统还可与其它自动化仪器
(
如真空

平板垫圈
(plate washer)、
离心机

培育箱

成像器

显微镜

板读取器

封口机和去皮器
)
相容

62.在一些变型中,微器官球体可以高于常规类器官的速率确立

例如,微器官球体内部的局部环境可促进生长因子

营养物和培育基
(
例如生长培育基
)
中的其它成分的交换以促进类器官的生长,而常规类器官圆顶产生营养物和生长因子梯度,此根据类器官在圆顶内的相对位置
(
例如在中心中相对在周边中
)
而显著影响其生物学

结果是离散肿瘤干细胞将遇到对于其增殖和重新汇集肿瘤样结构来说优化的环境的可能性较低

在一些变型中,微器官球体环境可提供针对主要营养物传播而优化的同质微环境,此增加确立成功率

63.本文所述的微器官球体还可比常规类器官更为异质

与常规类器官相比,微器官球体的体积将各原始细胞
(
例如肿瘤细胞
)
限制在更小的体积中

因此,通过快速分裂细胞的选殖接管
(clonal takeover)
受微器官球体的大小
(
例如直径
)
的限制

微器官球体的这种特性可促进生物和临床相关次殖株的分析

虽然这种隔离可在多个继代后丢失,但可分开回收和培育个别微器官球体,允许分离特定次殖株

分离不同选殖群体的能力还促进旨在理解促成药物敏感性和抗性的分子因子的研究

在一些变型中,可使用成像以识别和分离一个或多个不同次殖株

64.于微器官球体中生长的细胞可比常规类器官更可靠且更快地得到更能代表源组织或肿瘤的
3d
结构

例如,液滴内部的局部环境可促进培育基中生长因子

营养物和其它成分的交换,此促进类器官的生长

营养物遍和相对小

球形液滴中的扩散的促进可导致在更快时间尺度上确立的更高倾向

65.微器官球体和用于形成其的设备描述于第
pct/us2020/026275
号国际专利申请案中,且标题为“用于患者衍生的微器官球体的方法和设备
(methods and apparatuses for patient-derived micro-organospheres)”,所述案的全部公开是以全文引用的方式并入本文中

66.图
2a
为微器官球体形成系统
200
的示意图,所述微器官球体形成系统
200
包括微器官球体产生器
210、
样本源
212、
流体源
230、
输出
252
或一个或多个流体导管
216
中的一者或多者,流体导管
216
经结构设计成在输出
252
与微器官球体产生器
210
之间流体连通

微器官球体产生器
210
可包括多个微流体装置
214
,其经结构设计成同时制造
(
例如平行操作
)
微器官球体

在一些变型中,流体源
230
可包含本体油
(bulk oil)

/
或清洁流体

在一些变型中,输出
252
可包括经结构设计成分开接收多个微流体装置
214
的各别输出的多个回收容器

67.图
2b
为流体耦接聚合器
240
与输出
252
的去乳化器
250
的示意图

例如,去乳化器
250
可流体地耦接到聚合器
240
的输出和输出
252
可使用各别流体导管
216
流体耦接到去乳化器
250
的输出

在一些变型中,聚合器
240
和去乳化器
250
的温度可调节在约
37℃。
68.图
2c
为微器官球体形成系统
202
的示意图,所述微器官球体形成系统
202
包括微器官球体产生器
210、
样本源
212、
流体源
230
和聚合器
240。
在一些变型中,微器官球体产生器
210
可包括微流体装置
214。
微流体装置
214
可使用各别流体导管
216
流体耦接到样本源
212、
流体源
230
和聚合器
240。
例如,微流体装置
214
可接收来自样本源
212
和流体源
230
的输入,且将一个或多个微器官流体输出到聚合器
240。
在图
2c
中,微器官球体产生器
210
和聚合器
240
彼此分离

69.图
2d
为微器官球体形成系统
204
的示意图,所述微器官球体形成系统
204
包括微器官球体产生器
210、
样本源
212、
流体源
230
和聚合器
240。
在一些变型中,微器官球体产生器
210
可包括微流体装置
214。
微流体装置
214
可使用各别流体导管
216
流体耦接到样本源
212、
流体源
230
和聚合器
240。
例如,微流体装置
214
可接收来自样本源
212
和流体源
230
的输入,且将微器官球体输出到聚合器
240。
在图
2d
中,微器官球体产生器
210
和聚合器
240
可耦接在一起

70.在一些变型中,系统
200、202、204
和去乳化器
250
中的一者或多者可为压力和温度受控
(
例如调节
)。
在一些变型中,微流体装置
214
中的一个或多个部分可为可视化
(
例如可由用户查看,通过成像装置成像
)。
例如,微流体装置的接合
(
例如交叉
、t-接合
)
可为成像可见

在一些变型中,微流体装置
214
中的一者或多者可以预定时间间隔
(
例如在每次运行之后
)
灭菌
(
例如洗涤
)。
71.图
3a
为微器官球体形成系统
300
的示意图,所述微器官球体形成系统
300
包括微器官球体产生器
310、
开关
314、
样本源
330、
流体源
334
和输出
352。
在一些变型中,系统
300
可包括单一信道结构,其中所述微器官球体产生器
310
包括针对样本源
330、
流体源
334
和输出
352
中的每一者的单一信道

72.图
3b
为微器官球体形成系统
302
的示意图,所述微器官球体形成系统
302
包括微器官球体产生器
310、
开关
314、
样本源
330、
流体源
334
和输出
352。
在一些变型中,系统
302
可包括多信道结构,其中所述微器官球体产生器
310
包括针对样本源
330、
流体源
334
和输出
352
中的每一者的多个信道

多信道结构可允许灵活性,减少运行时间,且促进连续操作,以及各运行之间的清洁
(
例如洗涤

灭菌
)。
73.图
4a
为微器官球体形成系统
400
的平面图,所述微器官球体形成系统
400
包括微流体装置
412、

413、
开关
414(
例如嵌入式开关
)、
传感器
416(
例如输出流量传感器
)、
流体源
434(
例如
50ml
本体试剂
(bulk reagent))、
废液容器
436(
例如
50ml
废液模块
)、
输出
452(
例如
1.7ml
输出配接器
)
和贮集槽
453(
例如减少的样本贮集槽
)。

4b
为呈封闭结构
(
例如,其中所述盖为
413
,是封闭于微流体装置
412
之上
)
的微器官球体形成系统
400
的透视图和图
4c
为描绘为呈开放结构
(
例如,其中所述盖为
413
,经打开以促进存取微流体装置
412)
的微器官球体形成系统
400
的透视图

在一些变型中,当盖
413
呈封闭结构时,可进行微器官球体产生过程

在一些变型中,开放结构促进操作者存取微流体装置
412。
在一些变型中,盖
413
可包括透明部分,其经结构设计成实现目视微流体装置
412(
例如,以用于成像装置
)。
74.图7为微器官球体形成系统
700
的例示性变型的图像,所述微器官球体形成系统
700
包括微流体装置
712、
开关
714、

720(
例如流体泵

空气泵
)、
成像装置
732、
输出
752(
例如输出线
)
和输入设备
768(
例如开关控制
)。
75.微器官球体产生器
76.在一些变型中,微器官球体产生器
110(
例如
dmos、
产生器

液滴产生器
)
可包括至少部分封闭的包壳
(
例如外壳
)
,其中进行一个或多个自动化微器官球体形成步骤

例如,微器官球体产生器
110
可经结构设计成使用一个或多个开关
114、

120
和平台
122
将样本源
130
和流体源
134
转移到微流体装置
112


温度调节器
118
和泵
120
可经结构设计成促进微流体装置
112
中微器官球体
110
的形成

任选地,一个或多个传感器
116

/
或成像装置
132
可经结构设计成监测微器官球体形成过程

计算装置
160
可经结构设计成接收传感器数据和
/
或成像数据且用于控制微器官球体产生器
110。
一个或多个流体导管
(
例如连接器



连接器

线
)
可在微流体装置
114
与泵
120、
样本源
130、
流体源
134

/
或废液容器
136
之间流体连通

77.在一些变型中,微器官球体产生器
110
可包括透明窗和
/
或开口以实现目视微器官球体产生过程
(
例如样本

流体

混合物

微器官球体
)。
78.微流体装置
79.在一些变型中,微器官球体产生器
110
可包括一个或多个微流体装置
112
,其经流体耦接到样本源
130
或流体源
134
中的一者或多者

在一些变型中,微器官球体使用约5μ
l
到约
5ml(
包括之间的所有范围和子值
)
的样本体积从单一微流体装置
114
来形成

在一些变型中,样本体积可为约5μ
l、

10
μ
l、

20
μ
l、

35.3
μ
l、

50
μ
l、

100
μ
l、

250
μ
l、
和约
500
μ
l、

1ml、

1.5ml、

2ml、

2.5ml、

3ml、

3.5ml、

4ml、

4.5ml
或约
5ml。
80.在一些变型中,样本可包含少于约
10,000
个细胞到约
100,000
个细胞,包括之间的所有范围和子值

在一些变型中,样本可包含约
3,500
个到约
100,000
个细胞

在一些变型中,样本可包含约
3,500
个到约
7,500
个细胞

81.在一些变型中,形成的微器官球体可包含约
10
个细胞
/17nl
微器官球体


20
个细胞
/17nl
微器官球体或约
100
个细胞
/17nl
微器官球体
(
包括之间的所有范围和子值
)
的浓度

82.在一些变型中,微器官球体产生器
110
可包括同时操作的多个微流体装置
112
,从而实现较高通量并行操作

在一些变型中,微流体装置
112
可包括可释离的盖,其经结构设计成允许装置
112
的清洁和再使用

例如,一个或多个流体信道和微流体装置
114
可经灭菌
(
例如洗涤
)
以供再使用

在一些变型中,微流体装置
112
可包括透明部分,其经结构设计成用于目视且实现如本文更详细地描述的成像

83.在一些变型中,生物样本可在生物安全柜中制备且封闭
(
例如密封
)
于微流体装置
112
中,由此防止污染

在一些变型中,微流体装置
112
可与微器官球体产生器
110
一起使用

在一些变型中,微流体装置
112
可经结构设计成供单次使用
(
例如作为单次使用消耗品
(single-use consumable))。
84.图5为包括输入信道
512、
输出信道
520
和接合特征
530
的微流体装置
500
的例示性变型的横截面视图

在一些变型中,接合特征
(
例如凹口
)
可经结构设计成以预定结构装配到对应微器官球体系统
(
例如外壳
)


也就是说,接合特征可确保微流体装置
500
以预定定向加载且不以其它方式加载

在一些变型中,微流体装置
500
可经结构设计成产生包含约
300
μm的直径的微器官球体

在一些变型中,信道
512、520
可包括蛇形形状,所述蛇形形状经结构设计成最小化装置
500
大小同时维持具有预定背压的层流

在一些变型中,信道
512、520
的较大直径部分可经结构设计成防止初级样本
(
例如细胞结块
(cellular clump)、
蛋白质聚集物

碎片
)
堵塞微流体装置
500。
微流体装置
500
可为单次使用或多次使用装置

85.开关
86.在一些变型中,微器官球体产生器
110
可包括一个或多个开关
114(
例如阀
)
,其经耦接到微流体装置
112、
样本源
130、
流体源
134

/
或废液容器
136
且经结构设计成对微流体装置
112
提供输入
/
输出控制且确保样本源
130
与可重复的输出度量的一致处理

在一些变型中,开关
114
可通过计算装置
160
控制且可响应于例如通过传感器
116
产生的传感器数据和通过成像装置
132
产生的成像数据而操作

87.传感器
88.在一些变型中,微器官球体产生器
110
可包括一个或多个传感器
116
,其经结构设计成监测微器官球体形成过程的一个或多个组件和
/
或步骤

在一些变型中,所述一个或多个传感器
116
可包括一个或多个光学传感器

机械传感器

电压和
/
或电阻
(
或电容

或电感
)
传感器

力传感器

其组合等

在一些变型中,一个或多个传感器
116
可经结构设计成测定一个或多个参数,如流量

压力
、ph、
溶解气体浓度

渗透压

浊度

水合

导电率

吸亮度

营养物浓度

废液浓度

离子浓度

氧浓度

温度

其组合等

89.在一些变型中,经耦接到微流体装置
112
的流量传感器可经结构设计成产生传感器数据
(
例如流速数据
)
,其可由计算装置
160
接收以控制微器官球体产生器
110(
例如,开关
114、
温度调节器
118、

120)、
聚合器
140
或去乳化器
150
中的一者或多者

例如,当用于形成微器官球体时,细胞外基质
(

)
可包含宽广范围的粘度,此可导致恒定压力下的流速变化

在一些变型中,流量传感器可经结构设计成测定微流体装置
112
中的流速

一致流速可通过响应于测定的流速而改变压力
(
例如,经由泵
120)
来维持,由此改良液滴形成的一致性

在一些变型中,压力和温度可以传感器数据和
/
或成像数据中的一者或多者为基础来控制

90.在一些变型中,一个或多个传感器
(
例如接近度传感器
)
可经结构设计成测定产生器
110
包壳
(
例如敞开盖

封闭盖
)
的位置

也就是说,接近度传感器的独立部分可定位在盖
(
例如帽
(lid))
的侧且产生对应于敞开状态和封闭状态的信号

91.温度调节器
92.在一些变型中,微器官球体产生器
110
可包括一个或多个温度调节器
120。
温度调节器
120
可包括加热器

冷却器
(
例如帕耳贴
(peltier)
装置
)、
或经耦接到微器官球体产生器
110(
例如微流体装置
112、
开关
114、

120、
流体导管
)、
样本源
130、
流体源
134、
聚合器
140
或去乳化器
150
中的一者或多者的温度传感器中的一者或多者

在一些变型中,计算装置
160
可耦接到且经结构设计成以例如传感器数据和
/
或成像数据为基础控制温度调节器
118。
在一些变型中,温度调节器
118
可经结构设计成使温度活化水凝胶
(
例如
)
聚合

93.泵
94.在一些变型中,微器官球体产生器
110
可包括一个或多个泵
120(
例如流体泵
)
,其经结构设计成控制流体流入和流出微流体装置
112。
在一些变型中,一个或多个泵可经耦接
到与产生器
110
流体连通的流体导管且经结构设计成产生通过产生器
110
的预定流体流速以促进微器官球体组的形成

在一些变型中,泵
120
可包括正排量泵
(
例如蠕动泵
)、
离心泵或其组合等

在一些变型中,一个或多个样本源
130
可耦接到流体泵
120。
95.在一些变型中,泵
120
可包括一个或多个阀


120
可由计算装置
160
以预定方式控制

例如,一个或多个泵和开关可以预定顺序依序活化以确保具有可重复的输出度量的样本的一致处理

在一些变型中,泵
120
可经结构设计成产生约
100mbar
到约
1000mbar
的压力

96.平台
97.在一些变型中,微器官球体产生器
110
可包括一个或多个平台
122(
例如可移动的台

托架
)
,其经结构设计成使产生器
110
的一个或多个组件相对于彼此定位

例如,平台
122
可经结构设计成使微流体装置
112
相对于平台
122
保持
(
例如固定
)
就位

平台
122
可进一步结构设计成移动
(
例如以一个或多个自由度,沿着预定
x
轴和
/
或y轴移位
)
以便将微流体装置
112
定位在相对于样本源
130、
流体源
134
和成像装置
132
的预定位置

一旦定位,微流体装置
112
可例如接收来自成像装置
132
的光束,所述光束可允许成像和后续数据处理

在一些变型中,平台
122
可经结构设计成移动微流体装置
112
以用于与经耦接到样本源
130、
流体源
134、
废液容器
136
或类似者中的一者或多者的一个或多个流体线连接
(
以流体连通方式
)。
另外或是或者,平台
122
可经结构设计成将流体线朝着固定微流体装置
114
移动

98.样本源
99.在一些变型中,样本源
130
可包含一个或多个癌细胞

基质细胞

细胞系

非癌细胞

类器官

患者衍生的异种移植物

在控制或不受控制的化学计量下的细胞混合物

单细胞悬浮液

冷冻组织
(
例如人体生物数据库
(biobank))、
新鲜切除

生检
(
例如细针抽吸物
)
和细胞外基质
(ecm)(
例如
)、
其组合等

例如,样本可衍生自患者,如从小患者生检提取,
(
例如用于快速诊断以导引疗法
)
,衍生自切除的患者组织,包括切除的初级肿瘤或功能障碍器官的部分
(
例如用于高通量筛选
)。
用于形成微器官球体
(
例如离散组织
)
的样本组织
(
例如生检
)
可衍生自正常或健康生物组织,或衍生自遭受疾病或病患的生物组织,如衍生自肿瘤的组织或流体

用于微器官球体中的组织可包括免疫是统的细胞,如
t
淋巴细胞
、b
淋巴细胞

多形核白血球

巨噬细胞和树突细胞

在一些变型中,所述细胞可为干细胞

祖细胞或体细胞

在一些变型中,组织可为哺乳动物细胞,如人类细胞或来自动物
(
如小鼠

大鼠


)
的细胞

其组合等

在一些变型中,样本源
130
可包含发现于基质血管流份中的前脂肪细胞
(preadipocytes)、
间质干细胞
(mscs)、
肥大细胞

和脂肪组织巨噬细胞

血管和
/
或微血管片段

100.在一些变型中,微器官球体可包含一种或多种细胞类型,包括但不限于神经元

心肌细胞

肌细胞

软骨细胞

胰脏腺泡细胞

兰氏小岛
(islets of langerhans)、
骨细胞

肝细胞

柯弗氏细胞
(kupffer cells)、
纤维母细胞

成肌细胞

卫星细胞
(satellite cells)、
内皮细胞

脂肪细胞

前脂肪细胞

胆汁上皮细胞

其组合等

细胞可生检自骨髓

皮肤

软骨



骨骼

肌肉
(
包括心脏肌
)、
血管

角膜

神经



胃肠道



肝脏

胰脏
(
包括胰岛细胞
)、


垂体

甲状腺

肾上腺

淋巴

唾液

卵巢

睾丸

子宫颈

膀胱

子宫内膜

前列腺

外阴或食管组织中的一者或多者

101.一般来说,这些组织
(
和产生的细胞
)
可一般取自生检以形成微器官球体

因此,组织可衍生自生检

手术样本

抽吸

引流或含细胞流体中的任何者

适合的含细胞流体包括
血液

淋巴

皮脂液

尿液

脑脊髓液或腹膜液中的任何者

例如,在具有种植性转移的患者中,卵巢或结肠癌细胞可从腹膜液分离得

相似地,在患有子宫颈癌的患者中,子宫颈癌细胞可取自宫颈部,例如通过大切除转化区
(transformation zone)
或通过锥体生检

在一些变型中,微器官球体可含有驻留在原始组织或流体中的多种细胞类型

在一些变型中,所述细胞可直接从患者得到,无需次培育的中间步骤,或其可首先进行中间培育步骤以产生初级培育物

102.在一些变型中,不同样本类型
(
例如细胞
、ecm)
可在微流体装置
112
中混合之前配置于样本源
130
的独立腔室
(
例如管

贮集槽

隔室
)


在一些变型中,样本源
130
可设定在预定温度
(
例如
4℃、

4℃
到约
8℃)。
103.在使用细胞和
/
或细胞簇以形成微器官球体之前,可将样本
(
例如肿瘤样本
)
解离成细胞和
/
或细胞簇

104.成像装置
105.在一些变型中,系统
100
可包括一个或多个成像装置
132
,其经结构设计成产生通过控制器
(
例如处理器和存储器
)
处理的成像数据

例如,成像装置
(
例如摄影机
)
可经结构设计成成像微流体装置
112、
聚合器
140
或去乳化器
150
中的一者或多者以用于监测微器官球体形成过程

在一些变型中,所述混合物和
/
或微器官球体的一种或多种特性可至少以成像数据为基础来估算

在一些变型中,所述系统的温度和
/
或压力可至少以成像数据为基础来控制

例如,微流体装置
112
内的压力可以从成像数据估算的所形成微器官球体的大小和形状为基础而实时修改

106.在一些变型中,成像装置
132
可包括摄影机

透镜

光学传感器
(
例如带电荷的耦接装置
(ccd)
或互补金属氧化物半导体
(cmos)
光学传感器
)、
光源

其组合等

例如,光学传感器可为具有或不具有彩色滤光器数组和相关处理电路的
cmos

ccd
数组

在一些变型中,光源
(
例如,激光
、led、
灯或类似者
)
可经结构设计成产生可通过光纤电缆携载的光或成像装置
132
可包括经结构设计成提供照明的一个或多个
leds。
例如,成像装置
132
可包括一束可挠光学纤维
(
例如纤维镜
(fiberscope))。
纤维镜可经结构设计成接收且传播来自外部光源的光

107.在一些变型中,成像装置
132
可包括一种或多种显微镜检技术如共焦显微镜检,由于与类器官相比微器官球体的直径相对较小,因此实现完全堆积成像

一些常规生物成像系统受限于约
300
μm的成像深度

然而,类器官通常包含介于约
1mm
到约
2mm
之间的深度

因此,常规成像系统具有约三分的一或更少类器官的目视

在一些变型中,微器官球体可包含约
300
μm或更小的深度,所述深度允许对整个微器官球体进行高通量成像

此外,本文所述的微器官球体的一致性实现其在单一焦点平面上的对准,使得显微镜
(
例如共焦显微镜
)
可经结构设计成同时成像多个微器官球体

此外,微器官球体的较小相对大小
(
例如直径
)
允许增加的空间密度和意欲在单一视野中成像的较高数目的微器官球体

例如,微器官球体可为球形且具有约
14nl
的体积,此显著小于具有半球形圆顶形状和约
50
μ
l
的体积的类器官

因此,微器官球体
(
也就是说沿着焦点
z-轴
)
的深度可显著小于类器官

因此,微器官球体可使用完全堆积成像来成像,而常规类器官的厚度需要多平面中
(
例如
z-堆栈
)
的图像撷取以进行准确成像因此,常规微器官球体成像的速度和通量可相对于类器官成像改良


14
为使用本文所述的成像装置的一组识别的微器官球体
1410
的图像
1400。

14
显示各液滴
内的均匀分布的一组细胞

108.流体源
109.在一些变型中,微器官球体系统
100
可包括一个或多个流体源
134
,包括但不限于细胞外基质蛋白
(
例如纤连蛋白
)、
药物
(
例如小分子
)、


抗体
(
例如可调节细胞存活

增殖或分化中的任何者
)、
特定细胞功能的抑制剂

试剂

不可混溶的材料
(
例如疏水性


)、
天然凝胶

合成凝胶
(
例如水凝胶
)、
流体基质材料

其组合等

110.在一些变型中,流体基质材料可经结构设计成形成离散细胞分散在其内的撑体或支撑网络

在一些变型中,流体基质材料可包含一种或多种聚合物和水凝胶,包括胶原蛋白

纤维蛋白

壳聚糖

聚乙二醇

聚葡萄糖
(
包括化学可交联或光可交联的聚葡萄糖
)


以及电纺生物

合成或生物合成掺合物

例如,基质材料可为包含胶原蛋白1型
(
如从大鼠尾部得到的胶原蛋白1型
)
的凝胶

在一些变型中,凝胶可为纯胶原蛋白1型凝胶或可为除其它组分
(
如其它细胞外基质蛋白
)
的外包含胶原蛋白1型的凝胶

合成凝胶可指不天然存在于天然中的凝胶

合成凝胶的实例包括衍生自聚乙二醇
(peg)、
聚甲基丙烯酸羟基乙酯
(phema)、
聚乙烯醇
(pva)、
聚环氧乙烷
(peo)
等中任何者的凝胶

111.在一些变型中,水凝胶可包含聚合材料,包括但不限于藻酸盐

胶原蛋白
(
包括胶原蛋白i型和
vi

)、
弹性蛋白

角蛋白

纤连蛋白

蛋白多糖

糖蛋白

聚乳酸

聚乙二醇

聚己酸内酯

聚交酯
(polycolide)、
聚二氧杂环己酮

聚丙烯酸酯

聚氨酯

聚砜

肽序列

蛋白质和衍生物

寡肽

明胶

弹性蛋白

纤维蛋白

层连结蛋白

聚甲基丙烯酸酯

聚乙酸酯

聚酯

聚酰胺

聚碳酸酯

聚酸酐

聚胺基酸碳酸酯

多醣和经修饰的多醣

和其衍生物和共聚物以及无机材料,如玻璃,如生物活性玻璃

陶瓷

二氧化硅

氧化铝

方解石

羟磷灰石

磷酸钙

骨骼

其组合



112.在一些变型中,流体源
134
可包括一个或多个温度控制隔室

在一些变型中,流体的数量和量可足以供应多个制造运行

例如,加载细胞可确保流体源的量对于进行每次运行来说足够

113.废料容器
114.在一些变型中,微器官球体系统
100
可包括一个或多个废液容器
136
,其经流体耦接到微器官球体产生器
110

/
或去乳化器
150。
废液容器
136
可经结构设计成存储来自微器官球体形成过程的废液产物,如来自去乳化器
150
的油和
/
或其它废液产物

115.聚合器
116.在一些变型中,微器官球体系统
100
可包括一个或多个聚合器
140
,其经耦接到微流体装置
112
的输出且经结构设计成使所述混合物
(
例如液滴
)
聚合以形成微器官球体
(
例如液滴微器官球体
)


在去乳化之前,使混合物聚合可增加稳定性

在一些变型中,聚合器
140
可经结构设计成将混合物加热到预定温度
(
例如约
37℃
,约
10℃
到约
40℃
之间
)
一段预定时间量

在一些变型中,聚合器
140
可与微流体装置
112
整合或不同

例如,微流体装置
112
可经结构设计成在约
4℃
的温度下形成混合物

所述混合物可流入到微流体装置
112
内的聚合器
140(
例如加热腔室
)


聚合器
140
可经结构设计成使用温度调节器
118
的加热器在约
37℃
下使混合物聚合

例如,温度调节器
118
可经耦接到聚合器
140
周围的导热材料以均匀地将热量分配到混合物

聚合器
140
可包括一个或多个温度传感器,其经结构设计成产生微器官球体形成过程的死循环控制的传感器数据

另外或是或者,聚合器
140
可包含化学聚合
(
例如使用钙以使混合物聚合
)。
117.去乳化器
118.在一些变型中,微器官球体系统
100
可包括一个或多个去乳化器
150。
在一些变型中,可将在聚合之后形成的微器官球体浸渍于可通过去乳化器
150
移除的流体
(
如油
)


在从油分离之后,可将生长培育基引入到微器官球体

在一些变型中,去乳化器
150
可包括独立微流体装置,其经结构设计成将经聚合的液滴微器官球体从油过滤到生长
(
例如细胞培育
)
基中

119.图
6a
为以磁性分离为基础的去乳化器
600
的示意图

去乳化器
600
可包括第一入口
610a(
例如油和微器官球体入口
)、
第一出口
612a(
例如油和废液出口
)、
第二入口
620a(
例如生长培育基和洗涤入口
)
和第二出口
622a(
例如生长培育基和微器官球体出口
)。
第一入口
610a
和第二入口
620a
可配置于去乳化器
600
的第一侧和第一出口
612a
和第二出口
622a
可配置于去乳化器
600
的与第一侧相对的第二侧

在一些变型中,第一流体
(
例如油
)
和经聚合的微器官球体
650
的混合物可接收于第一入口
610a


第二流体
(
例如生长培育基

洗涤液

水性溶液
)
可接收于第二入口
620a


去乳化器
600
可经结构设计成用于层流,如图
6a
中所显示,使得来自第二入口
620a
的水性流体和来自第一入口
610a
的油的疏水特性不在去乳化器
600
内混合

相反地,第一流物流
630a(
例如油流物流
)
和第二流物流
632a(
例如水性流物流
)
经结构设计成平行流过去乳化器
600。
在一些变型中,去乳化器
600
可包括充当分流器的磁铁
640
,所述分流器经结构设计成将含有磁性奈米粒子的微器官球体
650
从第一流物流
630a(
例如油流物流
)
分离

在一些变型中,磁铁
640
经结构设计成沿着去乳化器
600
的预定长度延伸

当微器官球体
650
流过去乳化器
600
时,磁铁
640
可经结构设计成从所述第一流物流
630a(
例如油流物流
)
和第二流物流
632a(
例如水性流物流
)
分离微器官球体
650。
120.图
6b
为去乳化器
602
,经结构设计成利用层流特性和小微结构
(
例如微柱
)
以将经聚合的液滴从油过滤到培育基中

去乳化器
602
可包括第一入口
610b(
例如油和微器官球体入口
)、
第一出口
612b(
例如油和废液出口
)、
第二入口
620b(
例如生长培育基和洗涤入口
)
和第二出口
622b(
例如生长培育基和微器官球体出口
)。
第一入口
610b
和第二入口
620b
可配置于去乳化器
602
的第一侧和第一出口
612b
和第二出口
622b
可配置于去乳化器
602
的与第一侧相对的第二侧

在一些变型中,第一流体
(
例如油
)
和经聚合的微器官球体
650
的混合物可接收于第一入口
610b


第二流体
(
例如生长培育基

洗涤液

水性溶液
)
可接收于第二入口
620b


在一些变型中,去乳化器
602
可经结构设计成用于层流,如图
6b
中所显示,使得来自第二入口
620b
的水性流体和来自第一入口
610b
的油的疏水特性不在去乳化器
602
内混合

相反地,第一流物流
(
例如油流物流
(
未显示
))
和第二流物流
(
例如水性流物流
(
未显示
))
平行流过去乳化器
602。
在一些变型中,去乳化器
602
可包括分流器
660(
例如一组微柱,以经灰色填充的圆圈显示于图
6b

)
,其经结构设计成从第一流物流
(
例如油流物流
)
分离微器官球体
650(
以未填充的圆圈显示于图
6b

)。
分流器
660
可经结构设计成沿着去乳化器
602
的预定长度延伸

在微器官球体
650
流过去乳化器
602
时,分流器
640
的微柱可经结构设计成将微器官球体
650
从第一流物流
(
例如油流物流
)
和第二流物流
(
例如水性流物流
)
分离

在一些变型中,微柱可以与第一流物流
(
例如油流物流
)
呈约一度的角而定位于第二流物流
(
例如水性流物流
)
中,由此迫使微器官球体
650
从第一流物流进入到第二流物流,同时允许各流物流保持平行流动

微柱的间距可为使得微器官球体
650
无法通过微柱的间距且所述间
距可根据预期液滴大小在制造中变化

121.在去乳化器
600

602
的远程,第一流物流可经结构设计成流过第一出口
612a

612b
且第二流物流可经结构设计成流过第二出口
622a

622b。
在一些变型中,第一出口
612a

612b
可为与废液容器
(
未显示
)
流体连通,而第二出口
622a

622b
可为与输出
(
例如收集容器
)
流体连通以促进高百分比的形成的微器官球体的回收

与常规去乳化方法相反,如本文所述的去乳化器
600

602
可经结构设计成自动去乳化微器官球体而无需手动处置或离心

122.在一些变型中,去乳化可以连续上清液检定为基础

在一些变型中,可培育孔
(
例如
96
孔板
)
内的个别微器官球体使得可以预定时间间隔分离
(fractioned off)
上清液

可分开检定所收集的上清液

123.输出
124.在一些变型中,微器官球体系统
100
可包括一个或多个输出
152(
例如容器
(vessel)、
容器
(container)、
收集器



检定或回收容器
)
,其经结构设计成接收所形成微器官球体

在一些变型中,可将预定数目的微器官球体分配到多个孔中

在一些变型中,输出
152
可经结构设计成耦接到微器官球体

例如,微器官球体可强力地附接到孔的预定部分
(
例如在孔的底部的预定位置
)
,由此实现高通量处理,如快速基质交换和具有增加的对一种或多种化学和机械处理的抗性的固定成像

125.在一些变型中,输出
152(
例如孔板
)
可包括一个或多个涂层和纹理
(
例如图案
)。
在一些变型中,孔的底表面可经涂覆和
/
或图案化以促进微器官球体附接到底表面

例如,可将非特异性抗体附接到板的底部,其中所述抗体包含对蛋白质或形成微器官球体的骨架的其它分子的亲和力

因此,接触所述抗体的微器官球体可强力结合到板的底部

在一些变型中,一种或多种塑料可配置于输出的表面
(
例如孔的底部
)
上且经结构设计成附接
(
例如结合
)
到微器官球体

126.计算装置
127.在一些变型中,系统
100
可包括计算装置
160
,其包括控制器
(
例如处理器
162、
存储器
164)、
通讯装置
166、
输入设备
168、
显示器
170
或其组合

计算装置
160
可经结构设计成控制
(
例如操作
)
系统
100。
计算装置
160
可包括多个装置

例如,微器官球体产生器
110
可封闭计算装置
160
的一个或多个组件
(
例如处理器
162、
存储器
164、
通讯装置
166)
而计算装置
160
的一个或多个组件可远程提供到微器官球体产生器
110(
例如输入设备
168
或显示器
170)。
128.在一些变型中,控制器可经结构设计成接收对应于所述混合物或微器官球体组中的一者或多者的成像数据,且至少以成像数据为基础来估算所述组微器官球体的一种或多种特性

在一些变型中,控制器可经结构设计成接收对应于微器官球体组的成像数据,且至少以成像数据为基础来识别包含介于约
50
μm与约
500
μm之间的直径的所述组微器官球体

129.在一些变型中,控制器可经结构设计成至少以成像数据为基础来估算多个孔中的微器官球体数

130.在一些变型中,控制器可经结构设计成从所述一个或多个传感器接收传感器数据,且至少以传感器数据为基础来估算微器官球体组的一种或多种特性

在一些变型中,控制器可经结构设计成至少以成像数据和传感器数据为基础来修改所述泵或温度中的一者或多者

131.在一些变型中,控制器可经结构设计成至少以成像数据为基础来估算所述混合物的一种或多种特性

例如,所述混合物的特性中的一者或多者包括细胞总数和活细胞数

在一些变型中,控制器可经结构设计成至少以成像数据为基础来估算所述生物样本的一种或多种特性

例如,生物样本的特性中的一者或多者包括细胞总数和活细胞数

132.在一些变型中,控制器可经结构设计成接收对应于一个或多个微器官球体中一种或多种细胞,或一种或多种细胞的特性

133.处理器
134.在此描述的处理器
(
例如处理器
162)
可处理数据和
/
或其它信号以控制系统的一个或多个组件
(
例如微器官球体产生器
110、
成像装置
132
或计算装置
160)。
处理器可经结构设计成接收

处理

编译

计算

存储

存取

读取

写入和
/
或传输数据和
/
或其它信号

另外或是或者,处理器可经结构设计成控制装置的一个或多个组件和
/
或计算装置的一个或多个组件
(
例如控制台

触控屏幕

个人计算机

膝上型计算机

平板计算机

服务器
)。
135.在一些变型中,处理器可经结构设计成存取或接收来自微器官球体产生器
110、
成像装置
132、
服务器

计算装置
160
或存储媒体
(
例如存储器

快闪驱动

记忆卡

数据库
)
中的一者或多者的数据和
/
或其它信号

在一些变型中,处理器可为经结构设计成运行和
/
或执行一组指令或代码的任何适合的处理装置且可包括一个或多个数据处理器

图像处理器

图形处理单元
(gpu)、
物理处理单元

数字信号处理器
(dsp)、
模拟信号处理器

混合信号处理器

机器学习处理器

深度学习处理器

有限状态机
(fsm)、
压缩处理器
(
例如数据压缩以减少信号速率和
/
或记忆要求
)、
加密处理器
(
例如,针对安全无线数据转移
)

/
或中央处理单元
(cpu)。
处理器可为例如通用处理器

场域可程序门阵列
(fpga)、
应用特定集成电路
(asic)、
处理器板和
/
或类似者

处理器可经结构设计成运行和
/
或执行与系统相关的应用程序和
/
或其它模块

程序和
/
或功能

基础装置技术可提供于各种组件类型
(
例如金属氧化物半导体场效晶体管
(mosfet)
技术
(
像互补金属氧化物半导体
(cmos))、
双极技术
(
像射极耦合逻辑
(ecl))、
聚合物技术
(
例如硅共轭聚合物和金属共轭聚合物-金属结构
)、
混合模拟和数字等中

136.本文所述的系统

装置和
/
或方法可通过软件
(
于硬件上执行
)、
硬件或其组合进行

硬件模块可包括例如通用处理器
(
或微处理器或微控制器
)、
场域可程序门阵列
(fpga)

/
或应用特定集成电路
(asic)。
软件模块
(
于软件上执行
)
可以各种软件语言
(
例如计算机代码
)
表示,包括结构化文本
、typescript、c、c 、c#、python、ruby、visual

/
或其它面向对象

程序性或其它程序语言和开发工具

计算机代码的实例包括但不限于微代码或微指令

如通过编译程序产生的机器指令

用于产生网络服务的代码和包含通过计算机使用解释器执行的较高阶指令的文件

计算机代码的另外实例包括但不限于控制信号

加密代码和压缩代码

137.存储器
138.此处描述的微器官球体系统和装置可包括经结构设计成存储数据和
/
或信息的存储器
(
例如存储器
164)。
在一些变型中,存储器可包括随机存取存储器
(ram)、
静态
ram(sram)、
动态
ram(dram)、
存储器缓冲器

可抹除可程序只读存储器
(eprom)、
电子可抹除只读存储器
(eeprom)、
只读存储器
(rom)、
闪存

挥发性存储器

非挥发性存储器

其组合或类似者中的一者或多者

在一些变型中,存储器可存储指令以致使处理器执行与装置相关的
模块

程序和
/
或功能,如图像处理

图像显示

传感器数据

数据和
/
或信号传输

数据和
/
或信号接收


/
或通讯

本文所述的一些变型可关于一种具有非暂时性计算机可读取媒体
(
还可称为非暂时性处理器可读取媒体
)
的计算机存储产品,所述非暂时性计算机可读取媒体在其上具有用于进行各种计算机实施操作的指令或计算机代码

计算机可读取媒体
(
或处理器可读取媒体
)
为非暂时性的,因为其本身不包括暂时性传播信号
(
例如,传播电磁波携载信息于传输介质
(
如空间或电缆
)

)。
计算机代码
(
还可称为代码或算法
)
可为那些出于特定目的或多种目的而设计和建构者

在一些变型中,存储器可经结构设计成存储任何所接收数据和
/
或通过计算装置和
/
或成像装置产生的数据

在一些变型中,存储器可经结构设计成暂时或永久地存储数据

139.输入设备
140.在一些变型中,显示器可包括和
/
或可操作地耦接到输入设备
168(
例如触控屏幕
)
,其经结构设计成从用户接收输入数据

例如,输入设备
168(
例如键盘

按钮

触控屏幕
)
的用户输入可通过系统
100
的处理器
(
例如处理器
162)
和存储器
(
例如存储器
164)
接收和处理

输入设备可包括至少一个开关,其经结构设计成产生用户输入

例如,输入设备可包括供用户提供对应于用户输入的输入
(
例如手指接触于触控表面
)
的触控表面

输入设备
(
包括触控表面
)
可经结构设计成使用多种触控敏感性技术中的任何者来检测触控表面上的接触和移动,所述多种触控敏感性技术包括电容性

电阻性

红外

光学成像

分散性信号

声脉冲识别和表面声波技术

在包括至少一个开关的输入设备的变型中,开关可具有例如按钮
(
例如硬键

软键
)、
触控表面

键盘

模拟游戏杆
(
例如手游戏杆
(joystick))、
定向垫

鼠标

轨迹球

点动盘
(jog dial)、
步进开关

揺杆开关
(rocker switch)、
指针设备
(
例如记录针
(stylus))、
运动传感器

图像传感器和麦克风中的至少一者

运动传感器可从光学传感器接收用户移动数据且将用户手势分类为用户输入

麦克风可接收音频数据且识别用户语音为用户输入

141.在一些变型中,微器官球体系统可任选地包括除显示器之外的一个或多个输出装置,如例如音频装置和触觉感知装置

音频装置可听力输出任何系统数据

警报和
/
或通知

例如,当检测到故障时,音频装置可输出音响警报

在一些变型中,音频装置可包括扬声器

压电音频装置

磁致伸缩扬声器和
/
或数字扬声器中的至少一者

在一些变型中,用户可使用音频装置和信道来与其它用户通讯

例如,用户可形成音频信道
(
例如
voip
呼叫
)。
142.另外或是或者,所述系统可包括经结构设计成向用户提供另外感官输出
(
例如强制反馈
)
的触觉感知装置

例如,触觉感知装置可产生触觉反应
(
例如振动
)
以确认用户输入到输入设备
(
例如触控表面
)。
作为另一个实例,触觉感知回馈可通知处理器覆盖用户输入

143.通讯装置
144.在一些变型中,计算装置可包括通讯装置
(
例如通讯装置
166)
,其经结构设计成与另一个计算装置和一个或多个数据库通讯

通讯装置可经结构设计成通过有线或无线连接将计算装置连接到另一系统
(
例如因特网

远程服务器

数据库
)。
在一些变型中,所述系统可经由一个或多个有线和
/
或无线网络与其它装置通讯

在一些变型中,通讯装置可包括射频接收器

传输机


/
或经结构设计成与一个或多个装置和
/
或网络通讯的光学
(
例如红外
)
接收器和传输机

通讯装置可通过线和
/
或无线通信

145.通讯装置可包括经结构设计成接收和发送
rf
信号的
rf
电路
。rf
电路可将电信号转
换成电磁信号
/
从电磁信号转换成电信号且与通讯网络和其它通讯装置经由电磁信号通讯
。rf
电路可包括用于进行这些功能的众所周知的电路,包括但不限于天线系统
、rf
收发器

一个或多个放大器

调谐器

一个或多个振荡器

数字信号处理器
、codec
芯片组

订户识别模块
(sim)


存储器等等

146.透过所述装置中的任何者的无线通信可使用多个通讯标准

协议和技术中的任何者,包括但不限于全球行动通讯系统
(gsm)、
强化数据
gsm
环境
(edge)、
高速下行封包存取
(hsdpa)、
高速上行封包存取
(hsupa)、
演进

仅数据
(ev-do)、hspa、hspa 、dual-cell hspa(dc-hspda)、
长期演进
(lte)、
近场通讯
(nfc)、
宽带分码多重存取
(w-cdma)、
分码多重存取
(cdma)、
分时多重存取
(tdma)、
蓝牙

无线保真度
(wifi)(
例如
ieee 802.11a、ieee 802.11b、ieee 802.11g、ieee 802.11n

)、
国际网络协议上的语音
(voip)、wi-max、
电子邮件协议
(
例如因特网讯息存取协议
(imap)

/
或邮局协议
(pop))、
即时消息
(
例如延伸传讯和呈现协议
(xmpp)、
实时传讯和呈现利用延伸的对话启动协议
(simple)、
实时传讯和呈现服务
(imps))、

/
或短讯息服务
(sms)、ethercat、opc
统一架构

或任何其它适合的通讯协议

在一些变型中,本文中的装置可彼此直接通讯而不透过网络
(
例如透过
nfc、
蓝牙
、wifi、rfid

)
传输数据

147.在一些变型中,本文所述的系统

装置和方法可经由例如一个或多个网络与其它无线装置通讯,其中的各者可为任何类型的网络
(
例如有线网络

无线网络
)。
通讯可经加密或可不经加密

无线网络可指任何类型的数字网络,其未通过任何类型的电缆连接

无线网络中无线通信的实例包括但不限于蜂巢

无线电

卫星和微波通讯

然而,无线网络可连接到有线网络以便与因特网

其它载体语音和数据网络

商业网络和个人网络介接

有线网络通常于铜双绞线
(copper twisted pair)、
同轴电缆和
/
或光纤电缆之上携载

存在许多不同类型的有线网络,包括广域网
(wan)、
都会局域网络
(man)、
局部局域网络
(lan)、
局域网络局域网络
(ian)、
校区局域网络
(can)、
全球局域网络
(gan)(
像因特网
)
和虚拟专用网
(vpn)。
下文中,网络是指无线

有线

公共和私人数据网络的任何组合,所述无线

有线

公共和私人数据网络通常透过因特网互连,以提供统一网络和信息存取系统

148.蜂巢通讯可涵盖如
gsm、pcs、cdma

gprs、w-cdma、edge

cdma2000、lte、wimax

5g
网络标准的技术

有些无线网络部署将来自多蜂巢网络的网络组合或使用蜂巢
、wi-fi
和卫星通讯的组合

149.显示器
150.可将图像数据输出于微器官球体系统
100
的显示器
(
例如显示器
170)


在一些变型中,显示器可包括发光二极管
(led)、
液晶显示器
(lcd)、
电致发光显示器
(eld)、
电浆显示面板
(pdp)、
薄膜晶体管
(tft)、
有机发光二极管
(oled)、
电子纸
/
电子油墨显示器
(e-ink display)、
激光显示器和
/
或全像式显示器中的至少一者

在一些变型中,显示器
170
可整合为微器官球体产生器
110
的触控屏幕

151.ii.
方法
152.此处描述使用本文所述的自动化微器官球体系统和装置形成微器官球体的方法

例如,微器官球体可在包括微流体和微流体组件的单一端对端整合工作流程中形成

识别和估算

此外,所识别微器官球体可以一种或多种微器官球体特性精确分布为基础以实现例如快速药物筛选

图8为一般描述形成微器官球体的方法的变型的流程图

方法
800
可包
括从样本
(
例如患者衍生的组织样本
)
解离细胞
802。
在一些变型中,细胞可使用机械消化

酵素消化

其组合或类似者中的一者或多者来解离

可处理任何组织类型

在一些变型中,所述细胞可经混合以形成例如细胞和以为基础的混合物

在一些变型中,所述细胞还可经混合以形成细胞和本文所述的
matrigel
的任何替代物

153.在一些变型中,根据步骤
804
,可估算和
/
或测定一种或多种细胞特性

例如,离散细胞的一部分可经染色
(
例如
ao/pi)
以估算活细胞数和死细胞数

这些细胞估算值允许以预定浓度
(
例如每单位体积的活细胞数
)
形成微器官球体

样本的估算细胞特性
(
如接种密度
)
可使得具有高于预定阈值的死细胞数
(
或密度
)
的样本被排除

在一些变型中,具有预定数目的活细胞的微器官球体可以浓度为基础且通过控制所形成微器官球体的大小
(
例如直径
)
而形成

活细胞数可用于测定流体基质材料的体积以形成预定浓度的混合物

154.在一些变型中,可根据步骤
806
形成微器官球体组

在一些变型中,所述细胞可进行快速封装以形成具有预定空间分布的混合物的液滴

在一些变型中,可控制
(
例如,以温度和压力为基础
)
液滴的大小
(
例如直径
)
以形成包含预定细胞数和浓度的微器官球体

155.在一些变型中,根据步骤
808
,可估算和
/
或测定一种或多种微器官球体特性

在一些变型中,可估算每单位体积的微器官球体数

所述估算值可用于确保细胞类型组成和预期活细胞数满足预定标准,且允许控制封装后每个液滴的细胞数

例如,所形成微器官球体的一部分可经染色
(
例如
ao/pi
染色
)
以测定活细胞数和死细胞数


10

11
如本文更详细地描述说明离散细胞和液滴的估算过程的变化

在一些变型中,微器官球体形成可对应于每个液滴的细胞数的泊松采样分布
(poisson sampling distribution)。
在一些变型中,所述微器官球体组可在溶液中进行搅拌同时进行成像以改良微器官球体特性的估算

156.在一些变型中,可根据步骤
810
输出微器官球体组

例如,所述微器官球体组可用于药物检定接种
(plating)。
在一些变型中,在一个或多个容器
(vessel)(
例如孔

容器
(receptacle)、
容器
(container))
中的搅拌或受控分配中的一者或多者可实现泊松样本分布


12
说明如本文更详细地描述的搅拌和分配过程的一个变型

在一些变型中,可产生孔的成像数据以例如估算作为基线的输出微器官球体的数目和位置

在一些变型中,每孔的液滴数可用于定量分析结果的正规化

在一些变型中,若孔内的液滴数不符合预定范围,则一个或多个孔可被排除

157.在一些变型中,微器官球体可经搅拌以确保生长培育基内悬浮液中的均匀分布,而微器官球体经输出到例如孔板
(
例如细胞培育容器
(6
孔板到
1536
孔板
)
中的检定孔
)。
例如,可使用振荡烧瓶

手动吸移

揺杆等以确保微器官球体的均匀分布

在一些变型中,所述微器官球体组可使用吸移或液体处置器中的一者或多者输出

例如,液体处置器可经结构设计成直接从包含微器官球体的搅拌式容器吸移

158.在一些变型中,根据步骤
812
,可估算所述微器官球体组的一个或多个确立特性

例如,以定期时间间隔进行成像可确认确立微器官球体组且可实现例如以预定标准为基础接种微器官球体之后约2天到约8天内开始药物检定

相反地,使用常规类器官的药物筛选可能需要约6周到约8周来产生和形成具有足够数目的细胞以用于测试药物反应的类器官,此可为耗时且昂贵的,尤其作为诊断工具

在一些变型中,本文所述的微器官球体可在少于约2周内提供药物检定结果


13
说明配置于孔中的液滴的估算过程的一个变型,如本文更详细地描述

159.在一些变型中,成像装置可经结构设计成产生一组孔
(
例如孔板的各孔
)
的成像数据

处理器可经结构设计成使用一种或多种计算机视觉技术以成像数据为基础估算细胞经时的表面积和体积

例如,微器官球体的确立特性可包括微器官球体的大小

体积或生长速率中的一者或多者

在一些变型中,微器官球体可以一个或多个预定阈值
(
例如
70
μ
m2的中位面积,为初始细胞质量的双倍
)
为基础识别为已确立

160.在一些变型中,可分析成像数据以识别各微器官球体内具有大于预定阈值的直径
(
例如单细胞的预期直径
)
的一个或多个物体

因此,可仅识别多细胞或类器官体

例如,各微器官球体内识别的各物体的表面积
(
例如
μ
m2)
可经时
(
例如小时


)
估算和追踪

此方法可产生定量数据且处于高敏感度下以测定确立且实现药物给药投与

161.在一些变型中,微器官球体可在约一天内形成且可在形成之后约2天到约8天内确立

使用微器官球体的药物检定可在约4天或更短时间内运行,由此使用本文所述的系统和方法在约
14
天内实现功能诊断

162.图9为一般描述形成微器官球体的方法的变型的流程图

在一些变型中,方法
900
可包括根据步骤
902
,从样本
(
例如患者衍生的组织样本
)
解离细胞

例如,样本可机械和
/
或化学解离
(
例如酵素处理
)。
机械解离可包括中断缔合细胞之间的连接,例如,使用手术刀或剪刀或通过使用机器
(
如均质机
)。
化学解离可包括利用一种或多种酵素处理细胞以破坏缔合细胞之间的连接,包括例如胶原酶

分散酶
(dispase)、dna
酶和
/
或玻尿酸酶中的任何者

一种或多种酵素可在不同反应条件下使用,如在
37℃
下在水浴中或在室温下培育

163.在一些变型中,离散组织可经处理以移除死的和
/
或死亡中的细胞和
/
或细胞碎片

移除这类死的和
/
或死亡中的细胞可包括珠粒

过滤

抗体方法

其组合

或类似者中的一者或多者

例如,膜联蛋白
v-生物素结合接着生物素结合到链霉亲和素磁珠可实现从活细胞分离凋亡细胞

164.在一些变型中,来自患者的样本可为来自生检
(
例如,使用生检针或穿刺
)。
例如,生检可利用可插入到患者组织中以移除生检的
14

、16

、18

(

)
针来采取

165.在一些变型中,可将离散细胞悬浮于载体材料中

在一些变型中,载体材料可包含流体基质材料

在一些变型中,载体材料可为具有经结构设计成在微器官球体的聚合和形成之前延迟细胞于细胞悬浮液中的沉降的粘度水平的材料

在一些变型中,载体材料可具有足够粘度以允许离散生检组织细胞保持悬浮于悬浮液中直到聚合

在一些变型中,可流动或搅拌未聚合的材料以便保持细胞悬浮和
/
或根据需要分布

166.在一些变型中,根据步骤
904
,可选择一组离散细胞以进行分析

在一些变型中,根据步骤
906
,可估算所选组离散细胞的一种或多种特性

例如,如图
10
的方法
1000
中所显示,所选组
(
例如子组
)
离散细胞
1002
可经计数且用一个或多个活
(live)/

(dead)
染剂染色
1004。

/
死染剂的非限制性实例包括钙黄绿素
am(

)、
乙锭同型二聚体
(

)、
台盼蓝
(trypan blue)(

)、hoechst(

)
和吖啶橙
(ao)
和碘化丙啶
(pi)(ao/pi)。ao/pi
为以荧光为基础的细胞存活率检定,其中活细胞荧光绿
(
例如
526nm
最大发射波长
)
和死细胞荧光红
(
例如
617nm
最大发射波长
)。
检定输出
1006
可包括患者细胞样本中的细胞总数

活细胞总数和死细胞总数

167.在一些变型中,根据步骤
908
,可以一组离散细胞的估算特性为基础来设定一个或多个微器官球体产生参数

例如,图
10
的方法
1000
的结果可用于告知方法
1010
的微器官球
体产生参数,由此实现预定数目的活细胞
1012
与预定体积的流体的混合使得标靶数目的活细胞配置于各微器官球体
1014


微器官球体产生参数可包括流体流速

温度

压力或类似者中的一者或多者

168.在一些变型中,根据步骤
910
,可将离散细胞与流体基质材料组合以形成混合物
(
例如未聚合的混合物
)。
例如,所述混合物可包含离散细胞悬浮于所述混合物中

在一些变型中,所述细胞可在预定温度
(
例如在约
1℃
到约
210℃
之间
)
下保持悬浮且未聚合

未聚合的混合物可以液滴形式分配到不可混溶的材料
(
如油
)


液滴的大小和形状可对应于所形成微器官球体的大小和形状

例如,均匀大小的液滴可通过将未聚合的材料物流组合到不可混溶的材料
(
例如油
)
的一股或多股
(
例如,两股会聚
)
物流中而形成使得两股物流的流速和
/
或压力可决定未聚合的材料的液滴如何在其与不混溶的材料相交时形成

169.在一些变型中,微器官球体的大小
(
例如直径
)
可以系统中的压力或材料的粘度中的一者或多者为基础来控制

任一参数的变化均会改变所形成微器官球体的大小
(
例如直径
)
的一致性

例如,当各种液体
(
例如细胞和流体基质材料
)
到达交叉点
(
例如
t-接合
)
和组合时,需要时间来稳定跨系统的压力

压力变化将造成液滴大小的变异

例如,经引入到微流体产生器
(
例如微流体芯片
)
中的气泡可改变系统中的压力且因此改变所形成微器官球体的大小
(
例如直径
)。
170.另外或是或者,一个或多个液滴可通过印刷
(
例如通过将液滴印刷到表面上
)
形成

例如,液滴可经印刷到表面
(
如平坦或成型表面
)
上,且聚合

在一些变型中,液滴可使用自动分配器
(
例如吸移装置
)
形成,所述自动分配器适于将预定量的未聚合的混合物释放到表面上,释放到空气中,和
/
或释放到液体介质
(
包括不可混溶的流体
)


171.将非细胞物体引入到微器官球体中
172.另外或是或者,步骤
910
可包括通过组合一种或多种非细胞物体来形成混合物

例如,微器官球体可包括一个或多个非细胞物体

在一些变型中,非细胞物体可在微器官球体形成之前添加到细胞的混合物

在一些变型中,非细胞物体还可在其形成后并入到微器官球体中

在一些变型中,非细胞物体可包含惰性粒子

173.在一些变型中,各微器官球体可包含约1到约
10,000
个非细胞物体,例如约
10
到约
7,500



10
到约
5,000



100
到约
2,500
个非细胞物体

174.在一些变型中,非细胞物体可充当识别微器官球体的标识符
(
例如条形码
)。
在没有任何方式来识别微器官球体的情况下,若在微器官球体已移动之前和之后对特定孔进行成像,则可能很难或不可能将第一组和第二组图像中的微器官球体匹配以进行时移成像

因此,将标识符引入到微器官球体中可克服此种挑战且允许时移成像

在一些变型中,新增作为标识符的非细胞物体不影响生物过程

175.在一些变型中,非细胞物体可包含不同大小的粒子

发光器
(photophore)、
荧光团

荧光粒子

着色粒子

磁性粒子和
/
或可磁化粒子

如图
17
中所显示,在一些变型中,为了产生独特标识符
(
例如条形码
)
,可在微器官球体形成之前将a型粒子
1710(
例如磁性粒子和
/
或可磁化粒子
)

/
或b型粒子
1720(
例如不同大小的粒子

发光器

荧光团

荧光粒子和
/
或着色粒子
)
的高度可变源引入到c型粒子
1730(
例如细胞

细胞混合物

生物活性组分
)
的混合物中

例如,在混合过程期间对a型和
/
或b型粒子的随机取样可产生各微器官球体中a型和
/
或b型粒子的可独特识别的组合,其有效地充当各微器官球体的独特标识符
。a

、b

和c型粒子的组合可在细胞外基质
/
水凝胶
1740
中组合用于微器官球体产生
1750
以产生多组微器官球体
1760、1762、1764。
一个或多个标识符可在显微镜系统上读取且以视觉或算法译码,由此实现跨工作流程

重订格式步骤

机械操纵和各种其它应用
(
如流动式细胞测量术
)
的单一微器官球体追踪

在一些应用中,标识符允许微器官球体的高通量分选

176.在一些变型中,磁性粒子可包含一个或多个铁磁性

顺磁性或其它类型的磁性粒子

在一些变型中,磁性粒子可包含
fe3o4。
例如,磁性粒子允许透过使用磁铁来机械操纵和控制微器官球体,由此允许提高工作流程的各个步骤
(
如相分离
/
去乳化

快速基质交换和特定位置的微器官球体浓度
)
的效率和能力

例如,磁性粒子可允许将微器官球体浓缩为单一层于孔或培育板的底部以用于成像,于孔或培育板的中心以用于一个或多个微器官球体的成像,和
/
或于特定位置以促进微器官球体组的回收

177.细胞封装可包括各种形式

在第一变型中,可将单细胞悬浮液添加到细胞外基质以形成包含预定细胞数遍布液滴的微器官球体

在第二变型中,可将细胞在多个步骤中封装以便于较大细胞外基质液滴中建立细胞的高密度核

在这些变型中,单细胞可以高于第一变型的浓度再悬浮于细胞外基质中且封装于比第一变型中显著更小的液滴中

可使这些液滴聚合且再悬浮于新鲜未聚合的细胞外基质中

可再次处理此悬浮液而形成与第一变型大致相同大小的含有单一高密度聚合细胞核的新液滴

178.如图
19
中所显示,微器官球体产生可包括一种或多种形式的细胞封装

在情境
a(1910)
下,可将单细胞悬浮液加入到细胞外基质且微器官球体产生器可经结构设计成在产生时产生一组包含预定细胞数遍布液滴的微器官球体

然后可使这些液滴聚合且加以分析

或者,在情境
b(1920、1930)
中,可将细胞在多个步骤中封装以便于较大细胞外基质液滴中建立细胞的高密度核

在情境b中,可将单细胞以高于情境a的浓度再悬浮于细胞外基质中且封装于显著小于情境a的液滴中

可使这些液滴聚合且再悬浮于新鲜未聚合的细胞外基质中

可于微器官球体产生器上再次处理此悬浮液以建立与情境a相同大小的含有单一高密度聚合细胞核的新液滴

然后,这些液滴可遵循与情境a相同的操纵和分析程序

179.在一些变型中,微器官球体可经固定到表面

例如,微器官球体可经固定到孔或培育板的底部

180.若微器官球体包含磁性和
/
或可磁化粒子,则磁力可用于将微器官球体固定在预定位置

例如,磁力可施加到孔的中心

若使用高通量成像器,若所有微器官球体均可捕获于视野中且聚焦于孔的中心,则数据撷取可为高效的

181.在一些变型中,微器官球体还可透过生化构件固定于特定位置,此可包括利用细胞外基质凝胶的化学组合物以用特异性结合细胞外基质凝胶的抗体捕获以凝胶为基础的微器官球体

182.在一些变型中,抗体可以至少两种方式固定到孔或培育板的底部

在一些变型中,抗体可通过在高
ph、
低离子强度缓冲液
(
如磷酸盐缓冲盐水
(pbs))
中培育而直接结合到未处理的聚苯乙烯培育皿表面

在此环境中,抗体可优先透过与聚苯乙烯的疏水相互作用结合到表面

183.在一些变型中,培育板可在附接抗体之前用蛋白a或蛋白g预涂覆

由于蛋白
a/g
结合到抗体的
fc
区,因此此方法可将抗体的可变区正确定向到本体溶液
(bulk solution)
且远离板表面

在一些变型中,可将抗体在高
ph、
低离子强度缓冲液
(

pbs)
中培育以诱导对
板的结合

184.在一些变型中,可在洗涤后将约1到
10ug
抗体固定到板表面

一些细胞外基质凝胶由显著比例的胶原蛋白
iv
和层连结蛋白组成

用抗小鼠层连结蛋白和
/
或抗小鼠胶原蛋白
iv
抗体衍生化且与以的微器官球体为基础一起培育的培育板可导致其经由抗体固定到培育板

例如,图
18a

18b
为描绘用小鼠抗层连结蛋白和
/
或小鼠抗胶原蛋白
iv
抗体经由直接结合到聚苯乙烯
(

18a)
或蛋白a介导的连接
(

18b)
将培育板衍生化而导致将以
cultrex
的微器官球体为基础以抗体浓度依赖性方式固定化,将由于培育基变化而实现的损失最小化的线图

将数据绘制为平均值,其中误差表示为
96
孔板中每孔液滴的5次重复测量的
sem。
在一些变型中,在
37℃
下培育至少
16
小时后,可进行上清液交换,其中微器官球体损失最小

185.在一些变型中,微器官球体可通过离心沉积于孔或培育板的底部

就特定几何形状来说,微器官球体可集中在预定位置

186.在一些变型中,微器官球体可位于孔或培育板的底部的预定位置

例如,可于孔或培育板的底部制造图案以促进定位

在一些变型中,可于孔或培育板的底部蚀刻微坑以增加对微器官球体的亲和力

在一些变型中,在用具有对微器官球体的亲和力的材料涂覆孔或培育板的底部之后,可使用激光蚀刻器以从不需要微器官球体的所有位置移除涂层

图案不限于孔或培育板,且可施加到其它容器

187.在一些变型中,根据步骤
912
,可产生对应于微器官球体形成过程
(
例如细胞

流体基质材料

混合物
)
的传感器数据

例如,传感器数据可通过本文更详细地描述的是统
100
的一个或多个传感器
116
产生

188.在一些变型中,根据步骤
914
,可产生对应于微器官球体形成过程
(
例如细胞

流体基质材料

混合物
)
的成像数据

例如,如本文所述的成像装置
132
可经结构设计成产生对应于混合物形成
(
例如细胞和流体基质材料在交叉或接合处的交叉
)
的成像数据

在一些变型中,可成像所形成微器官球体以供进一步分析

189.在一些变型中,根据步骤
916
,可以传感器数据和
/
或成像数据为基础来估算混合物和
/
或微器官球体的一种或多种特性

例如,可处理成像数据以产生所形成液滴的大小分布

在一些变型中,一种或多种特性可包括每个液滴的细胞数

细胞于液滴中的分布

液滴大小
(
例如直径
)
或类似者中的一者或多者

190.在一些变型中,微器官球体特性可透过撷取无传感器数据的成像数据来估算

191.在一些变型中,可以图像数据为基础估算微器官球体特性

例如,图
10
的步骤
1010
说明所形成微器官球体子组可用
ao/pi
染色以计数每微器官球体的活和死细胞数

估算的特性可实现排除具有例如高于预定阈值的死细胞数
(
或密度
)
的运行

192.本文所述的系统和装置可允许形成包含预定细胞数的微器官球体

例如,将每微器官球体
20
个细胞作为目标的一组
25
次运行形成具有每个液滴
19.3
个平均活细胞和每个液滴活细胞%
cv(
内运行和间运行
)
分别为
13.3
%和
13.1
%的微器官球体

193.关于直径,图
11
说明可使用高通量显微镜检对所形成微器官球体
(
例如约
100
个液滴
)
子组成像

图像分析可产生平均直径和方差
(

cv)
的估算值

落在预定直径范围之外的运行可能被排除

194.本文所述的系统和装置可允许形成包含预定直径的微器官球体

例如,将
300
μm细
胞作为目标的一组
42
次运行形成具有
302
μm的平均直径和液滴直径%
cv(
内运行和间运行
)
分别为
20.2
%和
11.1
%的微器官球体

195.返回到方法
900
,在一些变型中,根据步骤
918
,可以估算的特性为基础更新一个或多个微器官球体产生参数

例如,可以估算的特性为基础调整样本和流体的温度和
/
或流体流速

此实现微器官球体形成过程的闭合回路控制以提高效率和产率

在一些变型中,可使用不具有传感器数据的成像数据以估算特性

可以估算的特性调整温度

流体流速和
/
或其它条件中的一者或多者为基础

196.在一些变型中,根据步骤
920
,可使混合物聚合以形成微器官球体组

在一些变型中,可使混合物
(
例如液滴
)
聚合以形成含在不可混溶的材料
(
例如油
)
中的微器官球体

例如,可将不可混溶的材料加热到引起未聚合的混合物
(
例如未聚合的材料中的流体基质材料
)
聚合的温度

197.在一些变型中,根据步骤
922
,可去乳化微器官球体组

例如,可通过洗涤以移除不可混溶的流体和
/
或通过使用关于图
6a
描述的去乳化器
600
或关于图
6b
描述的去乳化器
602
将微器官球体从不可混溶的流体分离

198.在一些变型中,根据步骤
924
,可搅拌微器官球体组

例如,图
12
说明经悬浮于溶液中的微器官球体组且经搅拌以更均匀地分布微器官球体

199.在一些变型中,根据步骤
926
,可输出微器官球体组

在一些变型中,可使用压力

声音

进料
(charge)、
其组合等来分配液滴

例如,如图
12
中所显示,可使用液体处置器以将预定体积的微器官球体
(
以预定浓度
)
分配到生长容器
(
例如
96
孔板
、384
孔板
、1536
孔板
)。
例如,控制分配在孔中的总细胞质量可有利于依靠细胞活性的定量测量

200.在一些变型中,根据步骤
928
,可产生微器官球体组的成像数据

例如,可成像和分析孔板的各孔中的微器官球体

在一些变型中,根据步骤
930
,可以成像数据为基础估算微器官球体组的一种或多种特性

例如,图
13
说明可使用高通量显微镜检对输出微器官球体子组进行成像

图像分析可产生每孔微器官球体的平均数量和方差
(

cv)
的估算值

落在预定值范围之外的运行可被排除

201.在一些变型中,液滴直径可通过系统的结构

样本对基质
(

)
的比率和每个液滴的细胞数来控制

液滴直径可通过经由高通量显微镜检和图像分析测定每次运行微器官球体形成之后的平均液滴大小和方差
(

cv)
来监测

在一些变型中,可成像约
100
个液滴的采样以估算平均液滴大小和方差

可重复未通过平均值和方差阈值的运行

202.本文所述的系统和装置可允许形成包含预定直径的微器官球体

例如,将
300
μm细胞作为目标的一组
42
次运行形成具有
302
μm的平均直径和液滴直径%
cv(
内运行和间运行
)
分别为
20.2
%和
11.1
%的微器官球体

203.本文所述的系统和装置可允许每孔输出预定数目的微器官球体

例如,将每孔
30
个微器官球体作为目标的一组运行具有每孔
31.2
个微器官球体的平均数目,和每孔的液滴数%
cv(
内运行和间运行
)
各为
20.6


204.在一些变型中,根据步骤
932
,可培育微器官球体组

例如,可将培育基提供到微器官球体以实现其确立和生长

在一些变型中,微器官球体可经培育任何所需时间,或可立即冷冻保存和
/
或检定

在一些变型中,微器官球体可经培育约1天到约3天

约1天到约4天

约1天到约5天

约1天到约6天

约1天到约7天

约1天到约8天

约1天到约9天

约1天到约
10


207.[0208][0209]
在一种例示性方法中,来自临床生检的组织样本可经切碎或切除且然后在约
4℃
下悬浮于温度敏感凝胶
(

)
中,且此后流过微流体液滴芯片

在一些变型中,经均质化组织样本中的细胞数可使用自动化细胞计数器来估算,且然后以特定所需密度再悬浮于凝胶中以便以预定液滴体积为基础提供预定细胞数
/
液滴

在一些变型中,微流体装置的核
t-接合可经结构设计成产生体积和材料组成基本上均匀的以凝胶为基础的油包水型液滴

凝胶中的经均质化的组织样本可经分配到液滴“微型反应器”中且所述凝胶可在约
37℃
下培育后固化

去乳化可从油相回收含有微器官球体的液滴

所得产物可包含例如与传统
3d
细胞培育技术兼容的数千个均匀凝胶肿瘤液滴

[0210]
在其它例示性方法中,可使用以图像为基础的方法来撷取
3d
结构
(
例如多细胞和细胞间接触
)
来周期性地监测患者
/
供者衍生的微器官球体,其可比
2d
培育形式更准确地仿真亲本肿瘤的生物学

在一些变型中,“确立”的测定是以以本文所述的成像数据为基础跨越大型代表性液滴样本的
3d
结构为基础的系统性撷取为基础来进行

成像数据可包括每天拍摄一次的显微镜图像,且经分析以估算可用于产生物体大小分布的曲线的液滴内部的物体的直径

在液滴物体超过代表单细胞的直径之后全身且一致地生长之后,样本可被视为“已确立”,且因此在生物上代表亲本肿瘤

[0211]
在一些变型中,具有大于约
700
μ
m2的测量表面积的微器官球体内的类器官可被视为已确立

类器官占用整个液滴的最大表面积为约
96,000
μ
m2。
由于检定孔可每孔具有多于一个液滴,因此当孔内的至少一个液滴符合一组预定标准
(
例如大于约
700
μ
m2的表面积
)
时,所述孔可被视为已确立且准备好用于下游检定

在一些变型中,当在孔中测定的液滴的约
30
%具有表面积约
700
μ
m2的至少一个类器官时,检定孔可被视为已确立

[0212]
如图
15a

15b
的图像
(1500、1510)
中所显示,当培育时,微器官球体中的类器官快速生长且确立自身为类器官

在初始生长阶段期间,单个液滴可包含多个类器官

随着时间的进行,多个类器官可合并成较大类器官且每个液滴形成单一类器官


16
的图像
(1600、1610)
允许将微类器官与常规类器官进行比较

例如,消化新鲜临床乳癌样本且一分为二以进行微器官球体和类器官产生

将微器官球体以
60
个细胞
/
液滴接种于
96
孔板中,且将等效数目的细胞
/
孔接种于圆顶中以用于在独立
96
孔板中进行类器官培育

约3天后,微器官球体早已形成大型
3d
结构
(

200
μm直径
)
且准备好用于药物检定,而在常规类器官培育物中的
3d
结构小且稀疏分布的

来自各培育物的代表性孔的
4x
图像显示于图
16
的各别图像
(1600、1610)


[0213]
本文所述的微器官球体可用作健康组织模型或患病组织模型

因此,本公开涉及一种测定患者对治疗的反应的方法,所述方法包括:
(a)
从患者得到具有细胞的生物样本;
(b)
将所述细胞封装于微器官球体中;
(c)
使所述微器官球体与治疗接触;
(d)
于所述微器官球体上进行检定;和
(e)
以来自所述检定的结果为基础测定对治疗的反应

在一些变型中,所述治疗包括药物或药物候选物

在一些变型中,治疗包括化疗

靶向或以免疫细胞为基础的疗法

值得注意的是,本公开允许例如在从患者接收细胞的约
14
天内快速评估患者对治疗的反应

在一些变型中,所述评估可包括测定健康组织对预定治疗
(
例如药物或药物候选物
)
的反应

在一些变型中,所述反应可包括毒性和
/
或另一种可测定的药物反应

[0214]
在一些变型中,所述检定为细胞存活率检定

细胞存活率检定的实例包括但不限于
celltiter-celltiter-3d、

/
死荧光标记和成像

[0215]
在一些变型中,所述检定为细胞上色测试,例如微器官球体中细胞的原位荧光染色

在细胞上色检定中,将一个或多个荧光团标记到一个或多个蛋白质
/
细胞或细胞外结构

例如,参见布瑞
(bray)
等人,“用于使用多工萤光染料的形態學概况分析的以细胞上色

高内涵图像为基础的检定
(cell painting,a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes)”,自然协议
(nature protocols)2016

11

1757-1774
,其内容是以引用的方式并入

[0216]
另外数据还可通过进行此项技术中已知的各种表征方法,如组织学
(
例如
dmos

ffpe
块的
e&h

ihc
染色
(e&h and ihc staining of ffpe blocks of dmos))、dna/rna
测试

本体细胞存活率
(bulk cell viability)
检定
(
例如
celltiter-/celltiter-3d)、
蛋白质体学和从上清液的
ctdna
检定获自生物样本和
/
或微器官球体

表征方法可对各微器官球体作为整体或其一部分
(
如微器官球体中的细胞或微结构
)
进行

细胞可从微器官球体提取以例如透过单细胞定序

流动式细胞测量术
、facs
或其它技术来独立地分析或操纵

表征方法还可对从具有微器官球体的溶液或悬浮液得到的上清液进行

[0217]
在一些变型中,生物样本为肿瘤组织

因此,除了微器官球体之外,对肿瘤组织本身进行的测量可提供另外数据以帮助测定患者对治疗的反应

[0218]
如本文所用,无菌应理解为对一些变型的非限制性描述,即一种提供本公开的某些系统和方法的操作上的优点的任选的特征

维持无菌性通常为细胞处理所需但可以各种方式来实现,包括但不限于提供无菌试剂

培育基

细胞和其它溶液;在装载后对匣和
/
或匣组件进行灭菌
(
保持细胞产物免于破坏
)
;和
/
或在无菌包壳

环境

建筑物

房间或类似者中操作所述系统

此用户或系统进行的灭菌步骤可使所述匣或匣组件无菌和
/
或保持所述匣
或匣组件的无菌性

[0219]
引用的所有参考文献均以全文引用的方式并入本文中

[0220]
如本文所用,除非本文另外清楚地指明,否则单数形式“一”、“一个”和“所述”包括多个指示物

除非另外规定,否则“和”如本文所用与“或”互换使用

[0221]
如本文所用,术语“基本上”、“约
(approximately)”和“约
(about)”一般表示规定值的平均加上或减去
10
%,例如,约
100
将包括
90

110。
[0222]
如本文所用,词组“和
/
或”应理解为表示如此共接合的组件中的“任一者或二者”,也就是说,在一些情况下共结合存在而在其它情况下分开存在的组件

以“和
/
或”列出的多个组件应以相同方式解释,也就是说,如此共接合的组件中的“一者或多者”。
可任选地存在除了由“和
/
或”条款具体识别的组件之外的其它组件,无论与具体识别的其组件相关或不相关

因此,作为一个非限制性实例,当与开放式语言如“包括”结合使用时,提和“a

/

b”可在一个变型中仅指
a(
任选地包括除b以外的组件
)
;在另一个变型中,仅指
b(
任选地包括除a以外的组件
)
;在又另一个变型中,是指a和
b(
任选地包括其它组件
)
;等

[0223]
如本文所用,术语“或”应理解为具有与如以上所定义的“和
/
或”相同的含义

例如,当将列表中的项目分开时,“或”或“和
/
或”应解释为包含性,也就是说,包含许多组件或组件列表中的至少一者,但还包括超过一者

和任选的另外未列出的项目

仅术语清楚地相反指示如“仅一者”或“恰好一者”,或当用于权利要求书中时,“由
......
组成”将指包含许多组件或组件列表中的恰好一个组件

一般来说,当在排他性术语
(
如“任一者”、“一者”、“仅一者”或“恰好一者”)
之前时,术语“或”如本文所用应仅解释为指示排他性替代
(
也就是说“一者或另一者但不是两者”)。“基本由
……
组成”当在权利要求书中使用时应具有其如专利法领域中所使用的寻常含义

[0224]
如本文所用,词组“至少一者”在关于一个或多个组件的列表时应理解为表示选自组件列表中的组件的任何一者或多者的至少一个组件,但不一定包括组件列表中明确列出的每一个组件中的至少一者且不排除组件列表中的组件的任何组合

此定义还允许可任选地存在除了词组“至少一者”所指的组件列表中具体识别的组件之外的组件,无论与具体识别的那些组件相关或不相关

因此,作为一个非限制性实例,“a
和b中的至少一者”(
或等效地,“a
或b中的至少一者”,或等效地,“a

/
或b中的至少一者”)
在一个变型中可指至少一个,任选地包括多于一个a,且不存在
b(
和任选地包括除b以外的组件
)
;在另一个变型中可指至少一个,任选地包括多于一个b,且不存在
a(
和任选地包括除a以外的组件
)
;在又另一个变型中可指至少一个,任选地包括多于一个a,和至少一个,任选地包括多于一个
b(
和任选地包括其它组件
)
;等等

[0225]
除非本文另外清楚地指明,否则本公开的任何方面的所有变型均可组合使用

[0226]
除非本文另外清楚地要求,否则在整个描述和权利要求书中,词语“包含
(comprise/comprising)”等应以包容意义而不是排他性或详尽意义来解释;也就是说,以“包括但不限于”意义来解释

使用单数或复数数量的词语还分别包括复数和单数数量

此外,词语“本文”、“上文”、“下文”和类似含义的词语在用于本技术案中时应指本技术案整体而非本技术案的任何特定部分

[0227]
尽管本文中已显示且描述本发明的变型,但所属领域的技术人员应理解这类变型仅以举例方式提供

所属领域的技术人员现将在不脱离本发明下做出许多变化

改变和替


应理解,本文所述的本发明变型的各种替代可用于实践本发明

希望随后权利要求书定义本发明的范围且由此涵盖这些权利要求书和其效物的范围内的方法和结构

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